木薯β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母的表面展示及催化合成烷基糖苷的研究

发布时间：2017-08-01 07:11

  本文关键词：木薯β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母的表面展示及催化合成烷基糖苷的研究

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【摘要】：烷基糖苷是一种“世界级”的“绿色”非离子表面活性剂。它具有表面张力小,起泡、分散、配伍性能好,去污能力优秀,无毒,对皮肤的刺激性小,可以被生物降解,可以由再生材料制得等诸多优点。普遍用于日化、农业、印染、纺织及石油等领域。目前工业上采用化学法来合成,但化学法存在一些缺陷,比如没有选择性,反应没有特异性,产物中会同时存在a和β异头物,反应过程需要高温高压,产品色泽较深。这不利于烷基糖的分离纯化,从而限制了其在食品药品领域的应用。与化学法相比,酶法合成具有选择性强、反应条件温和、过程简单等诸多优点。基于酵母细胞表面展示技术将木薯β-葡萄糖苷酶(MEBGL)展示在GS115细胞表面,制备成全细胞催化剂。这种固定化酶的方法非常简单、成本低,而且简单处理后就可回收再利用,克服了游离酶难以分离纯化和循环使用的缺点。全基因合成经过密码子优化的木薯β-葡萄糖苷酶基因mebgl,通过PCR进行扩增。以实验室原有质粒pKCALB-GCWn(n=12,19,21,51,61)为基础,构建重组质粒pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)。将构建成功的重组质粒经电转化转入毕赤酵母GS115。筛选出重组表面展示毕赤酵母GS115/pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)。将上述重组表面展示酵母以甲醇诱导产酶,采用以pNPG为底物的比色法测定水解酶活。测定的最适条件为,温度35℃;pH 6.0。GS115/pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)诱导168h后的最高水解酶活是0.56U/g(GCW21)。然后进行免疫荧光分析,荧光显微镜下可以观察到重组表面展示酵母发出的绿色荧光。相对于阴性对照菌,重组表面展示酵母菌的流式细胞仪峰图在X轴上存在着漂移。这都说明MEBGL已经成功展示在酵母表面。选用合成活力相对较高的GS115/pKMEBGL-GCW21进行合成烷基糖苷的研究。首先对其酶学性质进行评估。在底物浓度为10mM的情况下,对于pNPG,甲基-β-D-葡萄糖苷(MG),葡萄糖,纤维二糖和龙胆二糖五种底物来说。转化率最高的是pNPG,达到了52%。MG的转化率较低,仅为10%。该酶完全无法利用葡萄糖,纤维二糖,龙胆二糖合成烷基糖苷。以10mM的pNPG为底物,对于不同长度的受体脂肪醇来说,转化率随着碳链长度的增加而降低。正己醇的转化率最高,为70%。正辛醇的转化率比正己醇的稍低,为52%。十碳醇和十二碳醇,由于碳链过长,它们的转化率很低,分别为18%和2%。然后,对全细胞催化剂GS115/pKMEBGL-GCW21以pNPG和正辛醇为底物经转糖苷反应合成正辛基葡萄糖苷(OG)进行了研究。对于温度、pH值、酶粉添加量、含水量、底物浓度的单因素优化结果为,温度40℃,pH5.0,酶粉添加量0.05g,含水量50%,底物浓度30mM,转化率接近100%。然后,将底物浓度提高到50mM,70mM,含水量从35%到70%。底物浓度为50mM,含水量为50%时的转化率为74%。但随着底物浓度的进一步升高,转化率逐渐降低。当底物浓度为70mM时,转化率为37%。然后,进行三因素响应面实验。三个因素分别为酶粉添加量,含水量,底物添加量。使用Design-Expert.8.05b软件进行响应面实验的设计及数据拟合。利用拟合良好的模型预测并经实验证实的最适反应条件是酶添加量为0.05g,底物浓度为30mM,含水量为50%。
【关键词】：木薯β-葡萄糖苷酶 毕赤酵母GS115 全细胞催化剂 正辛基β-D-葡萄糖苷
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O647.2;Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 英文缩略词表13-14
• 第一章：绪论14-33
• 1.1 烷基糖苷表面活性剂概述14-17
• 1.1.1 烷基糖苷简介14-15
• 1.1.2 烷基糖苷的应用15-17
• 1.2 国内外烷基糖苷合成研究进展17-22
• 1.2.1 烷基糖苷工业发展现状17-18
• 1.2.2 化学法合成烷基糖苷18-19
• 1.2.3 酶法合成烷基糖苷19-22
• 1.3 木薯β-葡萄糖苷酶概述22-29
• 1.3.1 β-葡萄糖苷酶简介22-24
• 1.3.2 木薯β-葡萄糖苷酶概述24
• 1.3.3 木薯β-葡萄糖苷酶的催化机制24-26
• 1.3.4 木薯β-葡萄糖苷酶的催化性能26-29
• 1.4 毕赤酵母细胞表面展示29-30
• 1.4.1 毕赤酵母表面展示技术29-30
• 1.4.2 毕赤酵母表面展示MEBGL30
• 1.5 立题背景及意义30-33
• 1.5.1 立题背景30-31
• 1.5.2 立题意义31
• 1.5.3 本论文主要研究内容31-33
• 第二章：MEBGL的毕赤酵母表达菌株构建及分析33-55
• 2.1 引言33-34
• 2.2 实验材料34-38
• 2.2.1 实验试剂34-35
• 2.2.2 实验设备35-36
• 2.2.3 培养基与溶液的配制36-38
• 2.3.3.1 培养基的配制36-37
• 2.3.3.2 溶液的配制37-38
• 2.3 实验方法38-46
• 2.3.1 重组质粒pKMEBGL-GCW21的构建38-42
• 2.3.1.1 PCR引物的设计38
• 2.3.1.2 目的基因的PCR扩增及回收纯化38-39
• 2.3.1.3 从大肠杆菌中提取质粒pPIC9K39
• 2.3.1.4 质粒与目的基因的双酶切与回收纯化39-40
• 2.3.1.5 重组质粒pPIC9k/MEBGL-GCWn (n=12,19,21,51,61）的构建40
• 2.3.1.6 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞40-41
• 2.3.1.7 重组子的PCR验证和测序鉴定41-42
• 2.3.2 重组毕赤酵母菌株的构建和筛选42-46
• 2.3.2.1 重组质粒的线性化及纯化42
• 2.3.2.2 制备毕赤酵母GS115感受态细胞42-43
• 2.3.2.3 电击转化毕赤酵母43
• 2.3.2.4 重组毕赤酵母菌株的筛选和鉴定43-44
• 2.3.2.5 阳性重组菌中木薯β-葡萄糖苷酶的甲醇诱导表达44
• 2.3.2.6 MEBGL水解酶活力测定44-45
• 2.3.4.7 重组毕赤酵母菌株的免疫荧光标记处理及检测45-46
• 2.3.4.8 重组毕赤酵母菌株的催化性能比较46
• 2.4 结果与讨论46-53
• 2.4.1 木薯β-葡萄糖苷酶重组质粒的构建46-48
• 2.4.2 重组毕赤酵母表面展示菌株的构建及筛选48-49
• 2.4.3 重组毕赤酵母表面展示菌株的甲醇诱导表达49-51
• 2.4.4 重组毕赤酵母表面展示菌株的免疫荧光分析51-52
• 2.4.5 酵母细胞表面展示β-葡萄糖苷酶毕赤酵母催化性能分析52-53
• 2.5 本章小结53-55
• 第三章 毕赤酵母表面展示MEBGL转糖苷合成烷基糖苷55-73
• 3.1 引言55
• 3.2 材料55
• 3.2.1 实验试剂55
• 3.2.2 实验仪器55
• 3.3 实验方法55-59
• 3.3.1 毕赤酵母展示MEBGL全细胞催化剂的制备55-56
• 3.3.2 高效液相色谱HPLC-ELSD测定MEBGL的转糖苷合成活力56
• 3.3.3 高效液相色谱HPLC-ELSD定量分析烷基糖苷56-57
• 3.3.4 毕赤酵母表面展示MEBGL合成性质评估57
• 3.3.5 毕赤酵母表面展示MEBGL转糖苷合成OG的单因素优化57-59
• 3.3.6 毕赤酵母表面展示MEBGL转糖苷合成OG的进一步优化59
• 3.3.6.1 高底物浓度和含水量对反应的影响59
• 3.3.6.2 响应面优化实验59
• 3.4 结果与讨论59-72
• 3.4.1 高效液相色谱HPLC-ELSD定量分析烷基糖苷59-60
• 3.4.2 毕赤酵母表面展示MEBGL合成性质研究60-62
• 3.4.3 2mL体系中单因素条件对转糖苷合成OG的影响62-66
• 3.4.4 2mL体系高水含量和高底物浓度条件下转糖苷合成OG66-68
• 3.4.5 2mL体系中转糖苷合成OG的响应面优化68-72
• 3.5 本章小结72-73
• 结论与展望73-76
• 结论73-74
• 展望74-75
• 本文的创新之处75-76
• 参考文献76-82
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果82-83
• 致谢83-84
• 附表84

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本文编号：603014