蛋白组学分析沼泽红假单胞菌富集钴的机理研究

发布时间：2017-08-05 08:05

  本文关键词：蛋白组学分析沼泽红假单胞菌富集钴的机理研究

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【摘要】：过量的钴对农作物的生长和人体健康有严重危害。沼泽红假单胞菌属于光合细菌紫色非硫菌群红假单胞属,来源丰富,培养成本低,环境适应性强以及对重金属具有极强的耐受能力和富集能力。因此,研究该菌对重金属钴的富集条件及富集机理具有广阔的应用前景和重要的意义。本实验研究沼泽红假单胞菌对钴离子富集条件,并采用蛋白组学和荧光定量PCR技术比较该菌株在富集钴过程中蛋白质的表达变化,以及对某些相关的蛋白质的功能进行分析,初步揭示了沼泽红假单胞菌富集钴的机理。本论文主要研究了以下内容。1.研究4种不同代谢条件(厌氧光照、厌氧黑暗、好氧光照和好氧黑暗)对钴离子富集情况,确定在好氧黑暗条件下沼泽红假单胞菌对初始浓度为80mg/L钴离子去除率为89.4%。在此基础上,优化pH和温度对沼泽红假单胞菌富集,发现在pH=6.5,30℃时,对初始浓度为160 mg/L钴离子去除率达到84.9%,富集容量为287.18 mg/g。在共存离子实验中,Ni~(2+)会明显影响钴离子去除率,使钴的去除率降至59.67%,而Cu~(2+),Zn~(2+),Cd~(2+),Mn~(2+)和Fe~(2+)对钴离子的去除率几乎没有影响。在优化的实验条件下,沼泽红假单胞菌对钴离子的去除符合二级动力学特征(R2=0.9519-0.9931)。2.对沼泽红假单胞菌进行分区发现,细胞表面、细胞周质、细胞膜和细胞质对钴的富集容量分别为4.99,49.82,24.43,7.69 mg/g。其中,钴主要集中分布在细胞周质和细胞膜上,占菌体富集钴总量的85.32%。对富集钴和未富集钴的菌体进行X-射线衍射,发现未富集钴的菌体细胞呈无定型态,而富集钴后的菌体细胞有明显的衍射峰,通过与标准八水磷酸钴(JCPDS#01-0121)的数据比较分析,证明菌体富集钴后形成八水磷酸钴。3.建立分离沼泽红假单胞菌蛋白的双向凝胶技术,获得了分辨率高、重现性好的蛋白图谱。通过PDQuest软件分析对比钴离子浓度为80 mg/L和空白对照条件下蛋白质电泳图谱,发现有36个蛋白点发生了显著差异表达。采用MALDI-TOF-MS-MS质谱仪鉴定出25个蛋白质,其中19个蛋白点表达上调,6个蛋白点表达下调。利用NCBI数据库寻找匹配的蛋白质和GO数据库进行功能注释分析。按生物功能将25个差异蛋白可分为七类:蛋白质合成;蛋白质降解;应激蛋白;参与碳水化合物代谢;参与氨基酸代谢;转运蛋白和其他蛋白。这表明沼泽红假单胞菌富集钴的过程是一个复杂的网络调控体系,与菌体内部多个蛋白质表达有关。氨基酸代谢蛋白中甲硫氨酸腺苷基转移酶(METK)主要对细菌起到解毒作用;转运蛋白中磷酸酸根转运蛋白(PSTS)也大量表达,结合X-射线衍射和细胞分区,磷酸酸根转运蛋白在细胞周质中可能通过调控磷酸根来富集钴离子。4.提取钴离子浓度为80 mg/L和空白对照条件下的mRNA,利用逆转录技术得到cDNA。以SYBR GreenΙ为指示剂,通过荧光定量PCR对具有解毒功能的METK和调控磷酸根的PSTS基因进行实时监测,发现在富集钴过程中,这两个基因的表达量分别上调了4.03和12.99倍,这与双向凝胶电泳图谱上蛋白水平基本保持一致。从转录学水平验证说明METK和PSTS蛋白在沼泽红假单胞菌富集钴过程中具有重要意义。
【关键词】：沼泽红假单胞菌 富集钴 蛋白组学 差异蛋白 磷酸根转运蛋白
【学位授予单位】：成都理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O614.812;O657.3
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 前言10-19
• 1.1 引言10-11
• 1.1.1 重金属污染10
• 1.1.2 钴的来源与危害10-11
• 1.2 含钴废水主要处理方法11-13
• 1.2.1 化学沉淀法11
• 1.2.2 离子交换法11-12
• 1.2.3 膜分离法12
• 1.2.4 生物法12-13
• 1.3 光合细菌对重金属离子的富集研究13-15
• 1.3.1 野生光合菌富集重金属离子研究13-15
• 1.3.2 基因工程光合菌富集重金属离子研究15
• 1.4 蛋白质组学15-17
• 1.4.1 蛋白质组学研究技术15-16
• 1.4.2 蛋白组学分析微生物与重金属作用机理16-17
• 1.5 研究目的和意义17-19
• 第2章 沼泽红假单胞菌富集钴的研究19-29
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 主要试剂19-20
• 2.1.2 主要仪器20
• 2.1.3 RCVBN培养基20-21
• 2.2 方法21-22
• 2.2.1 沼泽红假单胞菌富集钴的条件优化21-22
• 2.2.2 钴在沼泽红假单胞菌中的分布22
• 2.2.3 X-射线衍射22
• 2.3 结果22-28
• 2.3.1 沼泽红假单胞菌富集钴的条件优化22-25
• 2.3.2 沼泽红假单胞菌对钴去除的动力学25-27
• 2.3.3 钴在沼泽红假单胞菌中的分布27
• 2.3.4 X-射线衍射分析27-28
• 2.4 讨论28-29
• 第3章 蛋白质的分离及质谱鉴定29-45
• 3.1 材料29-31
• 3.1.1 试剂29-30
• 3.1.2 主要仪器30
• 3.1.3 主要溶液配制30-31
• 3.2 方法31-34
• 3.2.1 蛋白质的提取31
• 3.2.2 蛋白质的纯化31-32
• 3.2.3 蛋白质的检测32
• 3.2.4 双向凝胶电泳32-34
• 3.2.5 蛋白胶内酶解34
• 3.2.6 质谱检测34
• 3.2.7 数据分析34
• 3.3 结果34-41
• 3.3.1 Bradford法测定蛋白质的标准曲线34-35
• 3.3.2 双向电泳条件优化35-36
• 3.3.3 差异蛋白谱图分析36-37
• 3.3.4 质谱的鉴定分析37-41
• 3.4 讨论41-45
• 3.4.1 双向电泳方法优化讨论41
• 3.4.2 质谱结果讨论41-45
• 第4章 METK和PSTS蛋白基因的转录定量分析45-53
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 试剂45
• 4.1.2 仪器与设备45-46
• 4.2 方法46-48
• 4.2.1 沼泽红假单胞菌总RNA提取46
• 4.2.2 逆转录反应46-47
• 4.2.3 实时荧光定量PCR扩增47
• 4.2.4 定量分析方法47-48
• 4.3 结果48-51
• 4.3.1 沼泽红假单胞菌RNA提取48
• 4.3.2 16S rRNA标准曲线48-49
• 4.3.3 实时荧光定量PCR结果49-50
• 4.3.4 METK和PSTS基因表达差异比较50-51
• 4.4 讨论51-53
• 4.4.1 RNA的提取51
• 4.4.2 qRT-PCR方法的选择51
• 4.4.3 mRNA与蛋白质表达水平之间的分析51-53
• 结论53-54
• 致谢54-55
• 参考文献55-61
• 攻读学位期间取得学术成果61-62
• 附录62-74

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1 白红娟;张肇铭;，

本文编号：623831