基于绿色溶剂的磁性固相萃取技术在蛋白质分离中的应用研究

发布时间：2017-08-16 13:01

  本文关键词：基于绿色溶剂的磁性固相萃取技术在蛋白质分离中的应用研究

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【摘要】：磁性固相萃取技术(Magnetic Solid Phase Extraction, MSPE)是以磁性材料作为吸附剂的一种分散固相萃取技术,该技术的关键是设计合成功能化的吸附剂。作为新型绿色溶剂的低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvent, DES)和离子液体(Ionic Liquid, IL)具有结构可设计性和易功能化的优点,固定至磁性颗粒上将得到负载型低共熔溶剂或负载型离子液体,将其作为磁性固相萃取技术的吸附剂,可以充分发挥低共熔溶剂或离子液体和磁性颗粒两者的优势。因而,与低共熔溶剂或离子液体相结合,磁性固相萃取技术将会得到更为广阔的应用。本研究设计合成两类绿色溶剂——低共熔溶剂和离子液体,结合磁性固相萃取技术,建立了萃取分离蛋白质的方法。主要内容如下：(1)氯化胆碱类低共熔溶剂修饰的磁性氧化石墨烯固相萃取蛋白质首先合成四种氯化胆碱类低共熔溶剂(DES),用来修饰磁性氧化石墨烯(Fe_3O_4@GO)合成Fe_3O_4@GO-DES复合物,再用于蛋白质的磁性固相萃取。用X-射线衍射仪、振动样品磁强计、傅里叶变换红外光谱仪、场发射扫描电子显微镜、热重分析仪对Fe_3O_4@GO-DES进行表征。以牛血清白蛋白(BSA)为研究对象,通过单因素实验考察了低共熔溶剂的种类、萃取温度、溶液离子强度、萃取时间、蛋白质浓度和Fe_3O_4@GO-DES加入量对萃取容量的影响。在最佳萃取条件下,萃取容量可达100.2 mg/g。萃取之后,选择0.005 mol/LNa2HP04-1 mol/LNaCI的水溶液作为洗脱液对含BSA的萃取剂进行洗脱,洗脱率可达90.9%。用圆二色谱仪(CD)测定了洗脱所得BSA的二级结构,结果表明其二级结构没有发生改变。另外,实验还将所提出的Fe_3O_4@GO-DES-MSPE技术应用于卵清蛋白(OVA)、溶菌酶(Lys)和牛血红蛋白(BHb)的萃取。所拟方法为蛋白质的分离纯化提供了一种新思路。(2)甜菜碱类离子液体修饰的磁性颗粒固相萃取蛋白质采用共沉淀法制备了Fe304,用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对Fe_3O_4进行修饰得到Fe_3O_4/APTES颗粒,再通过静电相互作用使其与GO结合形成磁性氧化石墨烯(Fe_3O_4/APTES/GO).用所合成的甜菜碱类离子液体修饰Fe_3O_4/APTES/GO颗粒得到Fe_3O_4/APTES/GO/IL,并将其应用于牛血清白蛋白(BSA)的萃取。用振动样品磁强计、X-射线衍射仪、傅里叶变换红外光谱仪、热重分析仪、场发射扫描电子显微镜、透射电子显微镜、Zeta电位分析仪对Fe_3O_4/APTES/GO/IL进行表征。通过单因素实验考察了离子液体种类、萃取温度、萃取时间、BSA浓度、溶液离子强度和溶液pH值对萃取容量的影响。在最佳萃取条件下,萃取容量可达139.1 mg/g。对比实验表明,Fe_3O_4/APTES/GO/IL对BSA的萃取能力明显大于裸露Fe304纳米颗粒以及Fe_3O_4/APTES/GO 对 BSA的萃取能力。以0.8 mol/L K2HPO4-1 mol/L NaCl的水溶液作为洗脱液对含有BSA的萃取剂进行洗脱,洗脱率可达95.5%。圆二色谱仪测定结果表明洗脱所得BSA的二级结构没有发生变化。实验还将小牛全血作为实际样品,考察了Fe_3O_4/APTES/GO/IL在实际应用中的萃取性能,结果令人满意。(3)聚合离子液体修饰的磁性颗粒固相萃取胰蛋白酶以一种阴离子含有不饱和键的离子液体为单体,通过共价键合的方法在3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)修饰的磁性Fe304颗粒(Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS)表面接枝离子液体聚合物(PIL),得到负载型聚合离子液体(Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS/PIL)。用振动样品磁强计、X-射线衍射仪、场发射扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱仪、热重分析仪、Zeta电位分析仪对Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS/PIL进行表征。以Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS/PIL为磁性固相萃取剂,胰蛋白酶(Try)为研究对象,进行了一系列的单因素萃取研究。在最佳萃取条件下,萃取容量可达182.7 mg/g。实验还比较了Fe_3O_4/SiO2、Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS和Fe_3O_4/SiO2/γ-MPS/PIL对Try的萃取能力。对含有Try的磁性固相萃取剂进行洗脱,并测定了超纯水中和洗脱液中Try的活性,它们的比活性Ur分别为1.0和0.83,这一实验结果表明,从磁性固相萃取剂上洗脱下来的Try的活性虽然低于其在超纯水中的活性,但是仍具有一定的活性。所拟方法为其他生物活性物质的萃取分离提供了一种思路。
【关键词】：磁性固相萃取技术 低共熔溶剂 离子液体 聚合离子液体 蛋白质
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O658.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 绪论13-27
• 1.1 蛋白质纯化13-16
• 1.1.1 蛋白质纯化的意义13
• 1.1.2 纯化蛋白质常用的方法13-16
• 1.1.3 问题与展望16
• 1.2 磁性固相萃取技术16-18
• 1.2.1 磁性固相萃取技术简介16-17
• 1.2.2 磁性颗粒的表面修饰17
• 1.2.3 问题与展望17-18
• 1.3 低共熔溶剂18-21
• 1.3.1 低共熔溶剂的组成18
• 1.3.2 低共熔溶剂的合成18-19
• 1.3.3 低共熔溶剂的性质19-20
• 1.3.4 低共熔溶剂的应用20-21
• 1.3.5 问题与展望21
• 1.4 离子液体21-25
• 1.4.1 离子液体的发展历史21-22
• 1.4.2 离子液体的组成22
• 1.4.3 离子液体的合成22-23
• 1.4.4 离子液体的特点23-24
• 1.4.5 离子液体的应用24
• 1.4.6 问题与展望24-25
• 1.5 聚合离子液体25
• 1.5.1 聚合离子液体概述25
• 1.5.2 问题与展望25
• 1.6 本课题的研究意义与研究内容25-27
• 1.6.1 本课题的研究背景与意义25-26
• 1.6.2 本课题的研究内容26-27
• 第2章 氯化胆碱类低共熔溶剂修饰的磁性氧化石墨烯固相萃取蛋白质27-43
• 2.1 引言27-28
• 2.2 实验部分28-32
• 2.2.1 试剂与仪器28-29
• 2.2.2 低共熔溶剂修饰的磁性颗粒(Fe_3O_4@GO-DES)的制备29-31
• 2.2.3 磁性固相萃取实验31-32
• 2.3 结果与讨论32-42
• 2.3.1 低共熔溶剂的表征32
• 2.3.2 Fe_3O_4@GO-DES颗粒的表征32-36
• 2.3.3 单因素实验36-38
• 2.3.4 Fe_3O_4@GO和Fe_3O_4@GO-DES萃取容量的比较38-39
• 2.3.5 洗脱与重复利用实验39-41
• 2.3.6 方法学考察41-42
• 2.4 小结42-43
• 第3章 甜菜碱类离子液体修饰的磁性颗粒固相萃取蛋白质43-59
• 3.1 引言43-44
• 3.2 实验部分44-47
• 3.2.1 试剂与仪器44-45
• 3.2.2 离子液体修饰的磁性颗粒(Fe_3O_4/APTES/GO/IL)的制备45-46
• 3.2.3 Zeta电势的测量46
• 3.2.4 磁性固相萃取实验46-47
• 3.2.5 实际样品的萃取实验47
• 3.3 结果与讨论47-58
• 3.3.1 离子液体的表征47-48
• 3.3.2 Fe_3O_4/APTES/GO/IL颗粒的表征48-53
• 3.3.3 单因素实验53-55
• 3.3.4 Fe_3O_4、Fe_3O_4/APTES/GO和Fe_3O_4/APTES/GO/IL萃取容量的比较55-56
• 3.3.5 洗脱与重复利用实验56-57
• 3.3.6 实际样品的萃取实验57-58
• 3.3.7 方法学考察58
• 3.4 小结58-59
• 第4章 聚合离子液体修饰的磁性颗粒固相萃取胰蛋白酶59-71
• 4.1 引言59-60
• 4.2 实验部分60-63
• 4.2.1 试剂与仪器60-61
• 4.2.2 聚合离子液体修饰的磁性颗粒(Fe_3O_4/SiO_2/γ-MPS/PIL)的制备61
• 4.2.3 磁性固相萃取实验61-62
• 4.2.4 胰蛋白酶的活性测定62-63
• 4.3 结果与讨论63-70
• 4.3.1 Fe_3O_4/SiO_2/γ-MPS/PIL颗粒的表征63-67
• 4.3.2 萃取对象的选择67
• 4.3.3 单因素实验67-68
• 4.3.4 Fe_3O_4/SiO_2、Fe_3O_4/SiO_2/γ-MPS和Fe_3O_4/SiO_2/γ-MPS/PIL萃取容量的比较68
• 4.3.5 洗脱与重复利用实验68-69
• 4.3.6 胰蛋白酶的活性分析69
• 4.3.7 方法学考察69-70
• 4.4 小结70-71
• 结论与展望71-73
• 参考文献73-86
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录86-87
• 致谢87

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本文编号：683401