乳及乳制品真实属性多重实时荧光PCR检测方法研究

发布时间：2017-08-17 07:08

  本文关键词：乳及乳制品真实属性多重实时荧光PCR检测方法研究

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【摘要】：运用实时荧光PCR检测技术对乳及乳制品中牛、羊、大豆、谷物及植物源性成分进行分析检测,以鉴定乳及乳制品的真实属性。在建立稳定的单重实时荧光PCR检测方法基础上,研究确立多重实时荧光PCR检测方法,实现乳及乳制品中多种目标物种基因的高通量快速筛查检测。本课题研究的主要内容和结果如下:(1)乳及乳制品DNA提取方法研究。本研究比较了异硫氰胍结合苯酚-氯仿法、改良试剂盒法和磁珠法这三种方法所提取乳及乳制品DNA的质量。结果证明,改良试剂盒法提取的核酸质量最高,本研究后续PCR反应中样本DNA提取均采用改良试剂盒法进行提取。(2)实时荧光PCR检测体系的建立。分别以牛cytb基因、羊12S rRNA基因、大豆lectin基因、谷物rbcL基因、植物tRNAleu基因作为靶基因合成特异性的引物与探针,建立各组分的单重实时荧光PCR检测体系,并设计实验验证合成引物和探针的特异性。通过验证,确定所合成的牛、羊、大豆、谷物及植物源性成分的引物与探针只针对目标物种DNA有扩增曲线,未出现非特异性扩增,说明所建立的PCR反应体系特异性良好。(3)多重实时荧光PCR检测体系的建立。通过对实时荧光PCR反应体系和反应参数优化,成功建立了单重、双重以及三重实时荧光PCR检测方法,实现牛、羊、大豆、植物、谷物源性各成分之间的实时同步检测。(4)方法特异性与灵敏度测试。通过阳性和阴性对照组DNA检测验证反应体系的通用性与特异性,并应用十倍倍比稀释目标物种DNA进行方法灵敏度测试,确定方法检出限。通过测试,牛、羊、大豆源性成分PCR检测体系的灵敏度均为0.1 ng的模板DNA,0.1%(w/w)的模拟样品;谷物源性、植物源性成分PCR检测体系的灵敏度均为0.1 ng的模板DNA,0.5%(w/w)的模拟样品。(5)市售样品的测试。通过收集市面上的乳与乳制品进行方法验证与样品测试,在收集的65份样品,其中在4份羊乳制品中检测出牛源性成分;在5份牛乳制品中检出植物源性成分和大豆源性成分。本研究建立了稳定高效的乳及乳制品中牛、羊源性主成分以及可能掺假掺杂的大豆、谷物、植物成分的实时荧光PCR检测体系。方法灵敏度高、特异性强,且可实现多重测试,适用于乳及乳制品真实属性的筛查检测。本研究所建立的方法为乳及乳制品监管提供可靠有力的技术手段,具有重大的经济效益与社会效益
【关键词】：乳制品 真实属性 检测技术 多重实时荧光PCR
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS252.7;O657.3
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 缩略词表10-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1.1 我国乳及乳制品市场概述11-13
• 1.2 乳及乳制品掺假掺杂检测技术研究进展13-16
• 1.2.1 传统检测方法在乳及乳制品掺假掺杂检测中的应用研究13
• 1.2.2 近红外光谱检测技术13-14
• 1.2.3 高效液相色谱技术在乳及乳制品掺假掺杂检测中的应用研究14
• 1.2.4 酶联免疫技术在乳及乳制品掺假掺杂检测中的应用研究14-15
• 1.2.5 实时荧光PCR技术在乳及乳制品掺假掺杂检测中的应用研究15-16
• 1.3 本论文研究的内容和意义16-19
• 第二章 乳及乳制品实时荧光PCR检测方法建立19-34
• 2.1 材料与方法19-25
• 2.1.1 实验材料、试剂与仪器19-20
• 2.1.2 方法20-25
• 2.2 结果25-31
• 2.2.1 不同提取方法的DNA提取结果25-26
• 2.2.2 单重实时荧光PCR特异性检测结果26-31
• 2.3 讨论31-34
• 2.3.1 三种DNA提取方法的分析比较31-33
• 2.3.2 单重实时荧光PCR检测体系的建立33-34
• 第三章 乳及乳制品多重实时荧光PCR检测方法建立34-46
• 3.1 材料与方法34-38
• 3.1.1 实验材料、试剂及设备同第二章；34
• 3.1.2 多重实时荧光PCR反应体系的建立及优化34-38
• 3.2 结果38-44
• 3.2.1 双重实时荧光PCR检测结果38-42
• 3.2.2 三重实时荧光PCR检测结果42-44
• 3.3 讨论44-46
• 第四章 方法灵敏度实验以及市售乳制品检测情况46-59
• 4.1 材料与方法46-47
• 4.1.1 实验材料、试剂与设备46
• 4.1.2 方法46-47
• 4.2 结果47-57
• 4.2.1 方法灵敏度测试结果47-50
• 4.2.2 模拟混合样品检出限实验50-53
• 4.2.3 市售羊乳制品样品测试结果53-57
• 4.3 讨论57-59
• 结论与展望59-62
• 参考文献62-65
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果65-66
• 致谢66-67
• 附件67

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