聚多巴胺包裹的磁性纳米粒子固定化脂肪酶及其催化二氢杨梅素酰化的研究

发布时间：2017-09-15 06:42

  本文关键词：聚多巴胺包裹的磁性纳米粒子固定化脂肪酶及其催化二氢杨梅素酰化的研究

  更多相关文章： 黑曲霉脂肪酶 磁性四氧化三铁纳米粒子 聚多巴胺 固定化 二氢杨梅素 酰化

【摘要】：二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DMY)是一种黄酮类化合物。它具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种功效,且是保肝护肝、解酒醒酒的良品。但是,二氢杨梅素的脂溶性较差,不易被人体的肝脏有效吸收,将其酰化成二氢杨梅素酯,可提高它被肝脏的利用效率。酶促二氢杨梅素酰化因其高效、绿色、反应条件温和、区域选择性高等优点而已引起人们的广泛关注。本文通过筛选得到一种脂肪酶(黑曲霉脂肪酶,Aspergillus niger lipase,ANL),其能有效地催化二氢杨梅素酰化,但是游离脂肪酶容易失活、难以重复回收利用的特点限制了其进一步在工业上的应用。因此,对ANL进行固定化能够很好地解决以上问题,产生重大的经济效益和社会效益。近年来,磁性四氧化三铁纳米粒子(MNPs)由于其超顺磁性、比表面积高、生物相容性好、低毒性等性质引起了研究人员广泛关注,然而,磁性四氧化三铁纳米粒子需要被表面修饰才能进一步被用作酶固定化的载体。受海洋生物贻贝粘附作用启发而制备的仿生材料聚多巴胺(polydopamine,PDA)制备过程简单温和,且聚多巴胺的表面含有酚羟基等具有高反应活性的基团可以进行二次反应,PDA越来越多地被应用在有机和无机材料表面的修饰中。本论文采用碱共沉淀法合成了MNPs,并利用多巴胺单体在类似海水的碱性(pH=8.5)条件下的自聚合作用在MNPs表面形成一层聚多巴胺层,从而得到聚多巴胺包裹的磁性四氧化三铁纳米粒子(PD-MNPs),通过对PD-MNPs进行了结构表征,结果表明MNPs的尺寸在10 nm左右,表面PDA层的厚度在4 nm左右,PD-MNPs具有良好的耐热性和超顺磁性,晶型仍然和MNPs一样。然后,以制备的PD-MNPs作为ANL的酶载体,利用聚多巴胺表层中的活性基团与含有氨基和巯基的ANL分子发生迈克尔加成或者席夫碱反应,将ANL固定在PD-MNPs表面,制备得到一种带有磁性的、高活性的、高稳定性的新型纳米级酶制剂ANL@PD-MNPs。并且探讨了不同pH、固定化时间对ANL@PD-MNPs酶活回收率的影响,结果表明在载体/酶质量比为4.8:1,固定化pH为8.0,固定化时间为12 h的条件下,酶的负载量为138 mg/g时,酶活回收率达到83.6%。系统研究了新型纳米级酶制剂ANL@PD-MNPs的酶学性质,并利用傅立叶红外光谱仪(FTIR)对游离ANL和ANL@PD-MNPs进行了二级结构分析。通过二级结构分析发现,固定化酶ANL@PD-MNPs二级结构中的α-螺旋和β-折叠含量相比于游离anl分别增加了2.74%、0.84%,结果表明anl经过固定化后,其结构刚性和稳定性均有所增强;固定化酶anl@pd-mnps最适ph为8.0,最适温度为40°c,同时,anl@pd-mnps酶活性构象结构的刚性得到增强,其耐受性(热稳定性、ph稳定性、溶剂稳定性)均要优于游离anl;此外,固定化酶anl@pd-mnps在4°c条件下储藏20d后,仍有92.8%的相对酶活回收率,远高于游离anl。酶反应动力学研究表明,游离anl的vmax/km值为4.07?10-4min-1,而anl@pd-mnps相应的vmax/km值为3.73?10-4min-1,anl@pd-mnps的底物亲和能力变强,酶活性中心更易与底物发生接触,在同等条件下其具有更强的催化能力。酶学性质研究表明,anl固定在pd-mnps后,其稳定性和催化活性均有所提高。研究了有机溶剂中anl@pd-mnps催化dmy酰化的反应。在所选择的酰基供体中,仅有乙酸乙烯酯在anl@pd-mnps催化作用下与dmy发生酰化反应,所得产物经过ms和nmr鉴定为二氢杨梅素-16-乙酸酯。固定化酶anl@pd-mnps催化该dmy乙酰化反应的最适底物摩尔比为(乙酸乙烯酯/dmy)10:1,最适温度为40°c,最适酶添加量为60u。在上述最适条件下,反应初速度和转化率分别为7.1mm/h、83.1%。在重复利用10次后,anl@pd-mnps相对活性仍超过55%,并且其区域选择性未受到影响。为了进一步提高固定化酶anl@pd-mnps催化dmy酰化反应效率,采用含深度共熔溶剂(des)的混合体系作为该反应介质。结果表明,在chcl:glycerol-dmso(1:3)混合溶剂中,anl@pd-mnps能够高效催化dmy与乙酸乙烯酯发生乙酰化反应,生成二氢杨梅素-16-乙酸酯。该反应的最适底物摩尔比为(乙酸乙烯酯/dmy)10:1,最适温度为45°c,最适酶添加量为50u。当底物浓度高达300mm时,该反应在chcl:glycerol-dmso(1:3)混合溶剂中反应初速度为55.2mm/h,反应24h后,转化率为85.3%;而在dmso中,反应初速度为34.9mm/h,反应48h后,转化率为78.8%。可见,在含des的混合溶剂中anl@pd-mnps催化dmy酰化反应效率明显提高了。dmy经过酰化后,其脂溶性增加,达到了0.635gdmy-16-乙酸酯/100g油,比dmy的溶解度几乎增加了10倍。此外,分离纯化dmy乙酰化产物,并对其抗氧化性进行了初步评价。二氢杨梅素-16-乙酸酯清除dpph自由基的ic50为4.16mg/ml、清除羟基自由基的ic50为1.79mg/ml、螯合fe2+的ic50为0.13mg/ml,表明二氢杨梅素-16-乙酸酯具有良好的抗氧化性。本论文首次研究了聚多巴胺包裹的磁性四氧化三铁纳米材料固定化黑曲霉及其高效催化二氢杨梅素酰化反应的研究。该新型纳米级酶制剂制备过程简单,能在磁场作用下实现酶与反应介质的迅速分离,具有酶载量高、酶活高、稳定性高的特点,并且能够有效催化二氢杨梅素酰化。该研究有助于丰富酶的国定化技术,深化对酶-载体相互作用的认识,所建立的生物催化体系可用于其它黄酮类物质的生物改性。
【关键词】：黑曲霉脂肪酶 磁性四氧化三铁纳米粒子 聚多巴胺 固定化 二氢杨梅素 酰化
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q814.2;O621.251
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 绪论16-29
• 1.1 脂肪酶16-18
• 1.1.1 脂肪酶的来源16
• 1.1.2 脂肪酶的结构及催化机理16-17
• 1.1.3 脂肪酶催化的反应及应用17-18
• 1.2 酶的固定化18-20
• 1.2.1 酶固定化的意义18-19
• 1.2.2 酶的固定化方法19-20
• 1.3 磁性纳米粒子20-22
• 1.3.1 磁性纳米粒子的制备20-21
• 1.3.2 MNPs作为酶载体的应用21-22
• 1.4 多巴胺修饰化学22-23
• 1.4.1 仿生粘附材料的起源和发展22
• 1.4.2 多巴胺仿生修饰的酶载体材料22-23
• 1.5 二氢杨梅素23-26
• 1.5.1 DMY的作用与功效23-25
• 1.5.2 DMY应用的局限性及改性研究现状25-26
• 1.6 含深度共熔溶剂体系中的生物催化26-27
• 1.7 本课题的主要研究内容与意义27-29
• 1.7.1 主要研究内容27
• 1.7.2 研究意义27-29
• 第二章 PDA包裹的MNPs的制备及表征29-37
• 2.1 实验材料29
• 2.2 主要仪器设备29
• 2.3 实验方法29-31
• 2.3.1 MNPs的制备29-30
• 2.3.2 PD-MNPs的制备30
• 2.3.3 PD-MNPs的表征30-31
• 2.4 结果与讨论31-36
• 2.4.1 MNPs和PD-MNPs的形貌、尺寸分析31-32
• 2.4.2 MNPs和PD-MNPs的XPS分析32-33
• 2.4.3 MNPs和PD-MNPs的红外光谱 (FTIR) 分析33-34
• 2.4.4 MNPs和PD-MNPs的X射线衍射 (XRD) 分析34-35
• 2.4.5 MNPs和PD-MNPs的热重分析 (TGA)35
• 2.4.6 MNPs和PD-MNPs的震动样品磁强计 (VSM)分析35-36
• 2.5 本章小结36-37
• 第三章 PD-MNPs固定化ANL的研究37-52
• 3.1 实验材料37
• 3.2 主要仪器设备37
• 3.3 实验方法37-40
• 3.3.1 ANL粗酶蛋白含量的测定37
• 3.3.2 ANL@PD-MNPs的制备37
• 3.3.4 脂肪酶酶活力和固定化酶蛋白负载量的测定方法37-38
• 3.3.5 固定化过程中各因素对酶固定化效果的影响38-39
• 3.3.6 ANL@PD-MNPs 的结构表征39
• 3.3.7 ANL@PD-MNPs的酶学性质的表征39-40
• 3.4 结果与讨论40-51
• 3.4.1 PD-MNPs/ANL质量比的确定40-41
• 3.4.2 ANL@ PD-MNPs制备过程中pH的确定41-42
• 3.4.3 ANL@ PD-MNPs制备过程中固定化时间的确定42-43
• 3.4.4 ANL@ PD-MNPs的形貌、尺寸43-44
• 3.4.5 ANL@ PD-MNPs傅里叶红外光谱分析蛋白二级结构44-45
• 3.4.6 ANL@PD-MNPs最适pH的研究45-46
• 3.4.7 ANL@PD-MNPs最适温度的研究46-47
• 3.4.8 游离ANL和ANL@PD-MNPs的动力学参数47-48
• 3.4.9 ANL@PD-MNPs的pH稳定性48
• 3.4.10 ANL@PD-MNPs的热稳定性48-49
• 3.4.11 ANL@PD-MNPs的溶剂耐受性49-50
• 3.4.12 ANL@PD-MNPs的储藏稳定性50-51
• 3.5 本章小结51-52
• 第四章 ANL@PD-MNPs催化DMY酰化反应的研究52-67
• 4.1 实验材料52
• 4.2 主要仪器设备52
• 4.3 实验方法52-57
• 4.3.1 PD-MNPs载体材料的制备52
• 4.3.2 固定化酶ANL@PD-MNPs的制备52
• 4.3.3 固定化酶ANL@PD-MNPs中的酶负载量以及酶活的测定方法52
• 4.3.4 固定化酶ANL@PD-MNPs催化二氢杨梅素酰化反应的一般过程52-53
• 4.3.5 高效液相色谱（HPLC）分析53
• 4.3.6 反应初速度、底物转化率、产物选择性的确定53
• 4.3.7 酰基供体对ANL@PD-MNPs催化DMY酰化反应的影响53-54
• 4.3.8 反应溶剂对ANL@PD-MNPs催化DMY应的影响54
• 4.3.9 底物摩尔比对ANL@PD-MNPs催化DMY酰化反应的影响54
• 4.3.10 温度对ANL@PD-MNPs催化DMY酰化反应的影响54-55
• 4.3.11 ANL@PD-MNPs量对其催化DMY酰化反应的影响55
• 4.3.12 ANL@PD-MNPs操作稳定性的研究55
• 4.3.13 DMY乙酰化产物的液质联用分析55
• 4.3.14 DMY乙酰化产物的分离纯化55-56
• 4.3.15 DMY乙酰化产物的核磁共振分析56-57
• 4.4 结果与讨论57-65
• 4.4.1 酰基供体对ANL@PD-MNPs催化DMY酰化反应的影响57
• 4.4.2 DMY乙酰化产物的HPLC-MS分析57-60
• 4.4.3 DMY乙酰化产物的结构鉴定60-61
• 4.4.4 反应溶剂对ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反应的影响61-62
• 4.4.5 底物摩尔比对ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反应的影响62-63
• 4.4.6 温度对ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反应的影响63-64
• 4.4.7 ANL@PD-MNPs加入量对其催化DMY乙酰化反应的影响64-65
• 4.4.8 ANL@PD-MNPs的操作稳定性研究65
• 4.5 本章小结65-67
• 第五章 含DES体系中ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反应的研究67-78
• 5.1 实验材料67
• 5.2 主要仪器设备67
• 5.3 实验方法67-70
• 5.3.1 ANL@PD-MNPs的制备67
• 5.3.2 ANL@PD-MNPs中的酶负载量以及酶活的测定方法67
• 5.3.3 DESs的合成67
• 5.3.4 在DESs或者混合溶剂体系中ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反应的一般过程67
• 5.3.5 在不同的DESs中ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化的研究67-68
• 5.3.6 不同比例混合溶剂对ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反应的研究68
• 5.3.7 底物摩尔比对ANL@PD-MNPs在ChCl:Glycerol-DMSO (1 : 3)中催化DMY乙酰化反应的影响68
• 5.3.8 酶量对ANL@PD-MNPs在ChCl:Glycerol-DMSO (1 : 3)中催化DMY乙酰化反应的影响68-69
• 5.3.9 ANL@PD-MNPs在反应介质ChCl:Glycerol-DMSO (1 : 3)中操作稳定性的研究69
• 5.3.10 DMY及DMY16乙酸酯脂溶性的测定69
• 5.3.11 DMY及DMY16乙酸酯的抗氧化性能力的研究69-70
• 5.4 结果与讨论70-77
• 5.4.1 在不同DESs反应介质中ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化的影响70-71
• 5.4.2 不同比例混合溶剂对ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反应的影响71-72
• 5.4.3 底物摩尔比对ANL@PD-MNPs催化DMY乙酰化反应的影响72-73
• 5.4.4 ANL@PD-MNPs酶量对其催化DMY乙酰化反应的影响73
• 5.4.5 ANL@PD-MNPs在反应介质ChCl:Glycerol-DMSO (1 : 3)中操作稳定性的研究73-74
• 5.4.6 DMY和DMY16乙酸酯脂溶性的测定74
• 5.4.7 DMY和DMY16乙酸酯清除DPPH自由基能力的测定74-75
• 5.4.8 DMY和DMY16乙酸酯羟基自由基清除能力的测定75-76
• 5.4.9 DMY和DMY16乙酸酯螯合Fe2+能力的测定76-77
• 5.5 本章小结77-78
• 结论与展望78-80
• 参考文献80-88
• 附录 校正曲线88-89
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果89-90
• 致谢90-91
• 附件91

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张友胜,杨伟丽,胡自勇;“增温溶解,保温过柱,温水解吸”提制二氢杨梅素(二)[J];天然产物研究与开发;2002年04期

2 张志坚;张晓元;李国林;印大中;郭勇;;二氢杨梅素对细胞等氧化伤害时的保护作用[J];湖南师范大学自然科学学报;2007年02期

3 郑秋，

本文编号：854928