成像分析活体内生物活性分子的新型共轭聚合物化学发光探针的构建及应用

发布时间：2017-09-16 21:35

  本文关键词：成像分析活体内生物活性分子的新型共轭聚合物化学发光探针的构建及应用

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【摘要】：生物活性分子调控细胞功能,与疾病的发生发展密切相关,然而有些活性分子的真实浓度极低或浮动极小。同时,生物体系复杂的背景荧光也极大地干扰对它们的准确检测。为全面阐述极低真实浓度或极小浮动的活性分子的生物学作用,亟需发展超高灵敏度的新型检测方法,从而实现对它们的准确检测。与传统的光致发光检测相比,化学发光(CL)探针无需激发光源,同时具有一些明显的优势,如生物背景信号干扰低、光损伤小、光散射导致的噪音低、反应速度快和检测范围宽。因此,基于CL的检测方法被广泛应用于生物活性分子的成像监控。但是,CL寿命短、发光强度低和发射波长短等缺点严重阻碍了该类探针的生物应用。针对上述问题,化学发光能量共振转移(CRET)由于能够提供更高的灵敏度、延长的发光时间和红移的波长,越来越受到人们的关注,被用以构建新型探针。同时,鉴于共轭聚合物(CPs)骨架的信号放大作用和可调的光学性质,因此CPs作为理想的能量受体,被成功用于成像检测领域。基于上述原因,我们利用CRET原理构建了一类新的共轭聚合物纳米探针,分别用于成像分析活体内本真浓度的超氧阴离子(O2~(·-))和碱性磷酸酶(ALP)。本论文开展了以下两方面的具体工作:1.O2~(·-)作为最早产生的活性氧(ROS),是细胞内许多其他ROS产生的前体和蓄水池。O2~(·-)在一些重大事件和疾病中,如细胞信号的转导、炎症、癌症、神经性退行性疾病,发挥关键的作用。然而,由于有机体内本真的O2~(·-)浓度是非常低的,目前,还未实现在无外源刺激下,活体中本真O2~(·-)水平的可视化成像。基于CRET原理,我们创新性地构建了一种聚合物纳米探针PCLA-O2~(·-)。该探针包括三部分:咪唑吡啶酮(CLA)与O2~(·-)之间的特异性反应,作为能量供体;具有信号放大性质的共轭聚合物(PFBT)作为能量的受体;拉近供体/受体距离的共价键连接体。在水溶液中,通过纳米沉降的方法,许多紧密的球状纳米颗粒形成。同时,疏水性的CLA嵌入到纳米粒子内部形成的疏水环境中,从而显著增强化学发光强度和延长化学发光时间。当加入O2~(·-)时,CLA与O2~(·-)发生化学反应产生490 nm的光,通过CRET,聚合物PFBT的荧光(560 nm)被激发。实验结果明显表明,探针具有达到pmol级超高灵敏度、延长的化学发光时间、优越的特异性和良好的生物相容性等优势。PCLA-O2~(·-)检测O2~(·-)的线性范围为0-950 pM,线性相关系数为0.9924,检测限达19.3 pM。在无外源激发光的情况下,PCLA-O2~(·-)实现了对活体正常/炎症组织中O2~(·-)的可视化检测。更重要的是,基于O2~(·-)水平的差异,我们首次成功可视化区分了正常/肿瘤细胞,以及小鼠的正常/肿瘤组织。这些优越的成果为特异性检测真实极低浓度的O2~(·-)提供了理想的成像材料。2.ALP的浓度异常经常与骨疾病、肝功能紊乱、乳房癌和前列腺癌的发生发展密切相关,被认为是重要的临床医学诊断的标志物。然而,目前,仍然缺乏高灵敏可视化成像活体内源性ALP的方法。因此,我们利用CRET机理设计合成了一种新型的聚合物纳米探针,探针包括三部分:识别底物AMPPD与ALP反应作为能量的供体;具有信号放大性质的共轭聚合物作为能量的受体;缩短共轭聚合物/AMPPD距离,同时提供疏水环境的β-环糊精。当加入ALP时,AMPPD与ALP发生化学反应,释放470 nm的光,通过CRET,聚合物的荧光被激发,发射680 nm的光。该探针有效地降低了背景荧光的干扰,提高了CRET的效率,从而实现了对ALP的超灵敏度检测。
【关键词】：化学发光能量共振转移 共轭聚合物纳米探针 超灵敏成像 超氧阴离子 碱性磷酸酶
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 绪论11-34
• 1.1 化学发光11
• 1.2 化学发光能量共振转移11-12
• 1.3 共轭聚合物12
• 1.4 基于化学发光，CRET或聚合物机理的探针12-14
• 1.5 活性氧在生物体中的重要作用14-15
• 1.6 检测O2~(·-)化学发光及荧光探针15-22
• 1.6.1 检测O2~(·-)化学发光探针15-18
• 1.6.2 检测O2~(·-)荧光探针18-22
• 1.7 ALP在生物体中的重要性22-23
• 1.8 ALP荧光探针综述23-26
• 参考文献26-34
• 第二章 基于化学发光能量共振转移机理超灵敏成像小鼠本真超氧阴离子的聚合物纳米探针的构建及应用34-63
• 1．引言34-36
• 2．实验部分36-47
• 2.1 仪器和试剂36-37
• 2.2 试剂纯化方法37
• 2.3 探针的设计37-38
• 2.4 探针的合成与表征38-44
• 2.5 实验材料部分44-47
• 3．结果讨论47-59
• 3.1 探针在化学体系中的化学发光分析47-56
• 3.2 探针在活体内的化学发光成像56-59
• 4．总结59-60
• 参考文献60-63
• 第三章 基于化学发光能量共振转移机理成像活体内碱性磷酸酶的聚合物纳米探针的构建及应用63-73
• 1. 引言63-64
• 2. 实验部分64-69
• 2.1 仪器和试剂64-65
• 2.2 试剂纯化方法65
• 2.3 探针的设计65-66
• 2.4 探针的合成与表征66-69
• 2.5 聚合物的光学性质分析69
• 3. 下一步工作计划69-71
• 参考文献71-73
• 附合成产物谱图73-80
• 作者发表的论文及参加的课题80-81
• 致谢81

【参考文献】

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1 Surapon Tangvarasittichai;;Oxidative stress,insulin resistance,dyslipidemia and type 2 diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2015年03期

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本文编号：865555