基于切割反应的电化学发光肽生物传感器检测基质金属蛋白酶

发布时间：2017-09-20 12:07

  本文关键词：基于切割反应的电化学发光肽生物传感器检测基质金属蛋白酶

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【摘要】：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)家族是一类锌离子依赖型内肽酶,其主要功能是消化特定的细胞外基质(extracellular matrix, ECM),在调节细胞凋亡、细胞增殖、肿瘤转移和侵袭等活动中起着重要作用。由于同肿瘤转移与侵袭有密切的关系,MMPs在肿瘤早期诊断和预后检测中常被作为生物标志物,如MMP2和MMP9在前列腺癌及乳腺癌中呈现出高表达,可以作为前列腺癌和乳腺癌初期诊断的标示物。另外,某些蛋白酶、酶激活剂或酶抑制剂可以加快肿瘤细胞的凋亡进程,作为药物用于肿瘤的治疗,如和蛋白酶相对应的特定底物多肽与经典的抗癌药物经化学连接得到低毒且具有靶向性的抗癌药物。因此,建立超灵敏、快速简便的单组分、多组分可视化的基质金属蛋白酶检测新方法,对原发性肿瘤和转移性疾病的早期诊断和药物筛选等具有重要意义。电化学发光(Electrogenerated chemiluminescence, ECL)是对电极施加一定的电压,进行电化学反应。通过反应产物与溶液中某组分或者反应产物之间进行化学反应产生的一种光辐射现象。电化学发光的信号检测的检测器主要有光电倍增管和CCD。由于电化学发光分析法的灵敏度高、重现性好、线性范围宽、易于微型化,其在食品检验、生物医药、环境监测、临床诊断等领域都引起了人们的广泛关注。以由固相合成法得到的多肽为分子识别物质,和抗体相比,具有环境耐受性好、合成成本低、分子量小以及极强的生物活性等优点,在生物标志物的检测中得到广泛的应用。本论文提出以肽为MMPs的识别底物,以电化学发光试剂钌联吡啶衍生物和新型铱金属配合物为信号物质,基于切割反应原理构建超灵敏型电化学发光生物传感器,用于基质金属蛋白酶的定量检测以及抑制剂的筛选。基于不同信号物质发光电位的不同,设计电位分辨型的电化学发光肽生物传感器用于多种基质金属蛋白酶的联合检测。本论文由引言和研究报告两部分内容组成。第一部分为引言部分,简要介绍了基质金属蛋白酶的定义、分类、作用以及功能,概述了基于多肽的电化学发光方法在生物分析方面的应用；着重综述了几类检测基质金属蛋白酶活性的方法；最后阐明了本论文的研究思路,研究目的以及研究内容。第二部分为研究报告,由以下两部分组成：一、电化学发光肽生物传感器检测活细胞分泌的基质金属蛋白酶2。本研究工作中,利用基质金属蛋白酶2(MMP-2)对底物多肽的识别作用,以钌联吡啶衍生物(Ru(bpy)2(mcbpy-O-Su-ester)(PF6)2,简称Ru1)为电化学发光标记物,基于切割反应原理建立了一种超灵敏检测MMP-2的方法。将信号物通过共价连接的方式结合到底物肽上,形成电化学发光探针(Ru1-peptide)之后,通过探针多肽CGPLGVRGK的C端基上的巯基和金电极间的Au-S键作用自组装到了金电极表面,得到了电化学发光生物传感器。当目标物MMP-2存在时,它能够选择性切断底物肽释放电化学发光标记物,在共反应试剂TPA作用下,电化学发光强度降低。结果表明,降低的电化学发光强度和MMP-2的浓度在1 ng/mL～50ng/mL和50 ng/mL～500ng/mL范围内分段成线性,其检出限为0.7ng/mL。该方法简单灵敏,且能够应用到活细胞分泌的MMP-2的检测,为临床上疾病相关的其他基质金属蛋白酶的检测提供了一种新思路。二、电位分辨型电化学发光肽生物传感器同时检测MMP-7和MMP-2。本工作以基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2)和基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7)作为目标物质,钌联吡啶衍生物(Rul)和铱金属配合物(Irl)作为两种电化学发光信号物,以各自的底物肽CGPLGVRGK和KRPLALWRSC为分子识别底物。基于Rul和Irl在金电极上电化学发光电位的不同,建立双电位法同时检测MMP-7和MMP-2的电化学发光分析方法。0.9 V处电化学发光强度的降低值和MMP-2的浓度在10ng/mL～300ng/mL间有良好的线性关系；1.4V处电化学发光强度的降低值和MMP-7的浓度在0.05ng/mL～1ng/mL之间呈良好的线性关系,检出限分别为5 ng/mL和10pg/mL。基于双电位响应的电化学发光生物传感器为临床诊断中复杂生物体系的研究提供了更多可能性,为多种肿瘤标志物的同时检测提供了一种简单、灵敏有特异性又可靠的方法。
【关键词】：电化学发光 肽 基质金属蛋白酶2 基质金属蛋白酶7 双电位
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 引言10-34
• 1.1 基质金属蛋白酶概述11-12
• 1.2 以肽为分子识别物质的电化学发光分析法12-19
• 1.2.1 电化学发光分析法概述12
• 1.2.2 肽的概述12-13
• 1.2.3 基于肽的电化学发光分析法13-19
• 1.3 基质金属蛋白酶的检测方法19-31
• 1.3.1 比色分析法20-21
• 1.3.2 荧光分析法21-25
• 1.3.3 电化学分析法25-30
• 1.3.4 其他分析方法30-31
• 1.4 本论文的研究目的以及研究内容31-34
• 第2章 电化学发光肽生物传感器检测活细胞分泌的基质金属蛋白酶234-52
• 2.1 引言34-35
• 2.2 实验部分35-37
• 2.2.1 仪器与试剂35-36
• 2.2.2 电化学发光探针(Ru1-peptide)的合成36
• 2.2.3 电化学发光生物传感器的制备36
• 2.2.4 电化学发光检测MMP-236-37
• 2.2.5 细胞培养37
• 2.3 结果与讨论37-50
• 2.3.1 电化学发光探针Ru1-peptide的表征37-39
• 2.3.2 电化学发光生物传感器的表征39-40
• 2.3.3 电化学发光生物传感器检测MMP-2可行性分析40-43
• 2.3.4 实验条件的优化43-44
• 2.3.5 电化学发光生物传感器的分析性能44-45
• 2.3.6 选择性45-46
• 2.3.7 抑制剂的选择46-47
• 2.3.8 样品分析47-50
• 2.4 小结50-52
• 第3章 电位分辨型电化学发光肽生物传感器同时检测MMP-7和MMP-252-68
• 3.1 引言52-53
• 3.2 实验部分53-55
• 3.2.1 试剂和仪器53-54
• 3.2.2 电化学发光探针的合成54
• 3.2.3 基于多肽的电化学发光生物传感器用于MMP-7的检测54-55
• 3.2.4 电化学发光肽生物传感器的构建55
• 3.3 结果与讨论55-66
• 3.3.1 Ir1的电化学发光行为55-59
• 3.3.2 电化学发光肽生物传感器的可行性59-63
• 3.3.3 电化学发光肽生物传感器的分析性能63-66
• 3.4 小结66-68
• 总结68-70
• 参考文献70-82
• 致谢82-84
• 攻读硕士期间主要研究成果84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 舒筱灿;王喜梅;王蕾;;基质金属蛋白酶及其抑制物与肿瘤转移研究进展[J];医学研究杂志;2009年11期

2 刘丰彬;段立公;;基质金属蛋白酶研究进展[J];山西体育科技;2005年03期

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本文编号：887947