基于纳米荧光探针的细菌芯片高效分析方法研究

发布时间：2017-09-21 04:13

  本文关键词：基于纳米荧光探针的细菌芯片高效分析方法研究

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【摘要】：面对国内外出现的多起严重威胁社会公共安全的食品和水源中致病菌中毒事件,以及现有致病菌检测技术存在的检测耗时长、检测设备庞大、操作繁杂等不足,本研究将微流控芯片技术和纳米技术结合,提出了高荧光强度、低背景干扰和高选择性纳米荧光探针标记的细菌荧光检测法和用于细菌高特异性、高灵敏、快速准确定量检测的细菌微流控芯片原位荧光检测法,为食品和水源中背景复杂、低含量的细菌(致病菌)的快速准确检测提供了新方法,对食品安全和环境卫生的评价具有重要研究价值和应用前景。本文的主要研究工作及结果如下:(1)吖啶橙荧光标记的细菌微流控芯片检测研究设计并制作了集成7通道PDMS-Glass微流控芯片,并以大肠杆菌JM109为模板菌种,采用荧光量子产率高达0.92的吖啶橙标记,采用荧光光谱仪及微流控芯片微型荧光检测仪检测,大肠杆菌JM109分别在10~2-10~6 cfu·mL~(-1)和103-105cfu·mL~-浓度范围内存在良好的线性关系。最后,以超市冻猪肉为实际样本,对其国标法预处理后,同样AO标记通入自行设计的7通道PDMS-Glass微流控芯片荧光检测和分析,多组测试结果显示猪肉样本表面含菌总数在103-104 cfu·mL~(-1)范围内,这与国标法-平板计数法测试结果基本一致,且检测时间从国标法的48 h缩短至不到4 h,极大的缩短了食源性致病菌检测时间,为食品安全快速检测提供了新思路,也为现场便携式细菌快速检测提供了新途径。(2)自制壳层式AO@SiO_2-NH_2荧光纳米探针定量检测金黄色葡萄球菌以吖啶橙(AO)为荧光内核材料,通过改进的反相微乳液法合成了呈规则球形大小均一,单分散性好,平均粒径为80 nm左右,表面带氨基且光稳定性较好的核壳结构AO@SiO_2-NH_2荧光纳米粒子。进而以金黄色葡萄球菌为实验样本,通过戊二醛分步交联将自制的AO@SiO_2-NH_2作为高效低毒荧光标记探针对金黄葡萄球菌进行标记并进行荧光检测,金黄色葡萄球菌浓度对数与相应的荧光信号强度在103-107 cfu·mL~(-1)的浓度范围内呈良好的线性关系,线性回归方程为:I FL=69.188log(c)-161.28,线性相关系数达到0.9814,检出限达到5×10~2 cfu·mL~(-1)。将该方法用于合成样本中金黄葡萄球菌细菌进行检测,回收率在96.5%-102.7%之间,RSD小于7%(n=5)。该方法具有简单直接、条件温和、检测时间短、灵敏度高和线性范围宽(跨越5个数量级)等优点。(3)基于石墨烯-碳点FRET效应和适配体特异性识别的鼠伤寒沙门氏菌微流控细菌芯片检测利用石墨烯对适配体自动吸附及其荧光猝灭特性,提出特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的纳米荧光碳点-适配体(CDs-Apt)识别探针,设计制作了电沉积氧化石墨烯微流控阵列芯片,搭建了微流控芯片-LED诱导荧光原位检测分析微系统,针对鼠伤寒沙门氏菌建立了高灵敏性、高选择性和高通量的细菌检测模式和方法。实验首先采用改良的Hummers法和水热法分别制备得到水溶性的单层氧化石墨烯和纳米荧光碳点;通过ITO导电玻璃上电沉积还原氧化石墨烯成功制备得到rGO/ITO微阵列芯片,并以芯片上沉淀的石墨烯为吸附基质和纳米淬灭剂,吸附识别探针CDs-Apt,构建的基于形成FRET原理的高灵敏荧光信号增强型微流控芯片传感平台,在CDs-Apt浓度为1μM,流速为1.0μL·min-1,淬灭时间和恢复时间分别为10 min和30 min的条件下,2 h内实现了鼠伤寒沙门氏菌的在线分析,且检测范围为10~2-10~6 cfu·mL~(-1),检出限为100 cfu·mL~(-1)。通过检验CDs-Apt/GO复合物与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的作用,证明该芯片传感系统对于目标菌具有高选择性和高特异性,同时将该方法用于自来水等合成样本中鼠伤寒沙门氏菌的检测,回收率在96.5%-102.0%之间,RSD小于6%(n=7)。这种简单、集成的高通量检测芯片,可发展为复杂样品的自动化、集成化分析检测平台,推广到其它的生物分析体系中。
【关键词】：新型纳米荧光探针 微流控芯片 细菌检测
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 1 绪论10-24
• 1.1 引言10
• 1.2 国内外研究现状及发展动态分析10-11
• 1.3 基于微流控芯片技术的食源性致病菌检测研究进展11-13
• 1.3.1 微流控芯片技术11-12
• 1.3.2 微流控芯片细菌分析检测技术12-13
• 1.4 细菌标记和检测的纳米荧光探针13-15
• 1.5 基于纳米荧光探针的微流控芯片细菌分析方法研究进展15-21
• 1.5.1 基于纳米金标记的微流控芯片细菌检测应用15-16
• 1.5.2 基于量子点（QDs）标记的微流控芯片细菌检测应用16-18
• 1.5.3 基于碳纳米材料标记的微流控芯片细菌检测应用18-19
• 1.5.4 基于荧光二氧化硅纳米探针标记的微流控芯片细菌检测应用19-21
• 1.6 研究意义及主要研究内容21-24
• 1.6.1 研究目的与意义21-22
• 1.6.2 研究工作的技术路线22
• 1.6.3 主要研究内容22-24
• 2 吖啶橙荧光标记的细菌微流控芯片检测研究24-34
• 2.1 引言24-25
• 2.2 实验部分25-27
• 2.2.1 仪器与设备25
• 2.2.2 溶液配制25-26
• 2.2.3 微流控细菌芯片制作26
• 2.2.4 吖啶橙（AO）标记细菌芯片荧光检测26
• 2.2.5 猪肉样本分析26-27
• 2.3 结果与讨论27-32
• 2.3.1 微流控细菌芯片设计27
• 2.3.2 微流控细菌芯片分析体系的构建27-28
• 2.3.3 吖啶橙（AO）直接标记大肠杆菌JM109的荧光光谱仪检测结果28-29
• 2.3.4 吖啶橙（AO）标记的大肠杆菌JM109的微流控芯片原位荧光检测结果29-31
• 2.3.5 芯片荧光原位检测法、荧光光谱仪检测法与国标平板计数法的对照分析31-32
• 2.4 本章小结32-34
• 3 自制壳层式AO@SIO_2-NH_2荧光纳米探针定量检测金黄色葡萄球菌34-48
• 3.1 引言34-35
• 3.2 实验部分35-37
• 3.2.1 试剂与仪器35-36
• 3.2.2 溶液的配制36
• 3.2.3 AO@SiO_2-NH_2 NPs的合成36
• 3.2.4 AO@SiO_2 NH_2 NPs的表征36-37
• 3.2.5 AO@SiO_2 NH_2 NPs标记金黄色葡萄球菌及定量分析37
• 3.2.6 金黄色葡萄球菌荧光定量检测37
• 3.3 结果与讨论37-46
• 3.3.1 AO@SiO_2 NH_2 NPs的设计原理37-38
• 3.3.2 AO@SiO_2 NH_2 NPs的表征结果38-42
• 3.3.3 AO@SiO_2 NH_2 NPs标记金黄色葡萄球菌定量分析结果42-45
• 3.3.4 样本分析45-46
• 3.4 本章小结46-48
• 4 基于氧化石墨烯-碳点FRET效应的鼠伤寒沙门氏菌微流控芯片检测研究48-66
• 4.1 引言48-49
• 4.2 实验部分49-53
• 4.2.1 试剂与仪器49-50
• 4.2.2 溶液的配制50
• 4.2.3 荧光碳点（CDs）及氧化石墨烯的合成50-51
• 4.2.4 荧光碳点（CDs）及氧化石墨烯的表征51
• 4.2.5 荧光碳点-沙门氏菌适配体复合物的制备51-52
• 4.2.6 多通道PDMS-rGO/ITO细菌芯片的制备52-53
• 4.2.7 多通道PDMS-rGO/ITO细菌芯片上鼠伤寒沙门氏菌的标记和在线检测53
• 4.3 结果与讨论53-64
• 4.3.1 荧光碳点（CDs）及氧化石墨烯的表征结果53-55
• 4.3.2 多通道PDMS-rGO/ITO芯片设计思路及其检测沙门氏菌的原理55-56
• 4.3.3 多通道PDMS-rGO/ITO芯片的制作及测试系统搭建56-58
• 4.3.4 微流控芯片上实现鼠伤寒沙门氏菌的定量检测和显微观测58-63
• 4.3.5 样本分析63-64
• 4.4 本章小结64-66
• 5 结论与展望66-68
• 5.1 结论66-67
• 5.2 展望67-68
• 致谢68-70
• 参考文献70-80
• 附录80
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录80
• B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目80

【参考文献】

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