β-N-乙酰己糖胺酶的异源表达及酶学性质研究

发布时间：2017-09-22 06:07

  本文关键词：β-N-乙酰己糖胺酶的异源表达及酶学性质研究

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【摘要】：几丁质是由N-乙酰-D-胺基葡萄糖(GlcNAc)单体通过β-1,4键组成的多糖,主要来源于昆虫与甲壳类动物,每年约有100亿吨的生物合成量,是地球上第二丰富的生物质。随着中国经济水平的发展,人民生活水平不断提高,蟹、虾等海产或水产甲壳类动物的消费量越来越大,但其壳却常被直接丢弃,导致几丁质未获得有效利用;且因几丁质在自然界中分解缓慢,还造成环境污染。几丁质可被内切几丁质酶水解生成壳寡糖,β-N-乙酰己糖胺酶可进一步水解壳寡糖生成GlcNAc。Glc NAc可应用于制药、功能性食品及化妆品等领域。目前,几丁质酶的商业化还面临很多的问题,其中一个重要的问题是β-N-乙酰己糖胺酶的活力低。此外,耐盐酶可应用于海产品加工等领域,在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源,但耐盐的β-N-乙酰己糖胺酶还尚未报导。本论文以解决几丁质的有效利用为目的,对3种β-N-乙酰己糖胺酶进行了异源表达和酶学性质研究。(1)本研究从3种细菌Sphingobacterium sp.HWLB1、Shinella sp.JB10和Microbacterium sp.HJ5中分别获得了重组β-N-乙酰己糖胺酶rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag,与已经报导酶学性质的β-N-乙酰己糖胺酶最高一致性分别为31%,41%和30%。(2)rHL1nag、rJB10nag及rHJ5nag的最适pH分别为pH 7.0、pH 6.0和pH 6.0,最适温度分别为40℃、50℃和45℃。(3)在最适条件下,rHJ5nag对2 mmol/L p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide和p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-galactosaminide、及0.50%(w/v)N,N'-diacetyl chitobiose和N,N',N'',N'''-tetraacetyl chitotetraose的比活分别为1773.08±1.06 U mg-1、145.97±3.13 U mg-1、481.43 U mg-1和445.05 U mg-1,该酶对2 mmol/L p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide的Km、Vmax和kcat分别为0.70 mmol L-1、4046.00 mol min-1 mg-1和4344.00 s-1。(4)NaCl抗性:在20%(w/v)的NaCl中,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag的酶活分别为127%、56%和54%。NaCl稳定性:经10%(w/v)NaCl处理1 h,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag的酶活分别剩余127%、75%和119%。(5)在25℃及pH 6.0条件下,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag与商业内切几丁质酶协同作用几丁质降解,协同度分别为3.57、2.35和2.02。本研究获得了具有高活力和高耐盐性的β-N-乙酰己糖胺酶,其协同参与几丁质的有效降解,在几丁质的酶法加工及利用中具有潜在的应用价值,也为β-N-乙酰己糖胺酶相关活性机理的研究提供了良好的素材。
【关键词】：几丁质 β-N-乙酰己糖胺酶 比活 耐盐性
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 术语及符号说明10-11
• 第1章 绪论11-24
• 1.1 几丁质及其降解产物的应用11-12
• 1.2 β-N-乙酰己糖胺酶研究概况12-20
• 1.2.1 几丁质酶与 β-N-乙酰己糖胺酶12-14
• 1.2.2 β-N-乙酰己糖胺酶的分类14
• 1.2.3 β-N-乙酰己糖胺酶的来源与性质14-16
• 1.2.4 β-N-乙酰己糖胺酶的结构16-17
• 1.2.5 β-N-乙酰己糖胺酶的酶学性质17-19
• 1.2.6 β-N-乙酰己糖胺酶的功能19-20
• 1.3 β-N-乙酰己糖胺酶的应用20-22
• 1.3.1 β-N-乙酰己糖胺酶在几丁质降解中的应用20
• 1.3.2 β-N-乙酰己糖胺酶在绿色农药中的应用20-21
• 1.3.3 β-N-乙酰己糖胺酶在医学上的应用21
• 1.3.4 β-N-乙酰己糖胺酶在水生生态毒理学中的应用21-22
• 1.4 研究目的和意义22-23
• 1.5 研究内容23-24
• 第2章 重组 β-N-乙酰己糖胺酶基因的异源表达及纯化24-46
• 2.1 实验材料24-27
• 2.1.1 菌株和质粒24
• 2.1.2 主要仪器24-25
• 2.1.3 主要试剂25
• 2.1.4 常用溶液25-26
• 2.1.5 常用培养基26-27
• 2.1.6 DNA测序与引物合成27
• 2.2 实验方法27-33
• 2.2.1 序列分析27
• 2.2.2 原核表达载体的构建27-29
• 2.2.3 重组质粒的转化29-30
• 2.2.4 重组 β-N-乙酰己糖胺酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的诱导表达30
• 2.2.5 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的纯化和鉴定30-33
• 2.3 实验结果与分析33-43
• 2.3.1 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的基因表达33-34
• 2.3.2 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的纯化和鉴定34-37
• 2.3.3 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的序列分析37-43
• 2.4 讨论43-44
• 2.5 本章小结44-46
• 第3章 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的酶学性质46-82
• 3.1 实验材料46-47
• 3.1.1 主要试剂46
• 3.1.2 常用溶液46-47
• 3.2 实验方法47-57
• 3.2.1 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的定量47
• 3.2.2 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的酶活测定方法47-49
• 3.2.3 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的酶学特性分析49-57
• 3.3 实验结果与分析57-79
• 3.3.1 重组 β-N-乙酰己糖胺酶r HL1nag的酶学性质研究57-65
• 3.3.2 重组 β-N-乙酰己糖胺酶r JB10nag的酶学性质研究65-72
• 3.3.3 重组 β-N-乙酰己糖胺酶r HJ5nag的酶学性质研究72-79
• 3.4 讨论79-81
• 3.5 本章小结81-82
• 第4章 总结与展望82-86
• 4.1 总结82-85
• 4.2 创新85
• 4.3 展望85-86
• 致谢86-87
• 参考文献87-96
• 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果96-97
• 附录97-105
• 附录A 实验中所使用的缓冲液的配置97-99
• A1 不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制97-98
• A2 不同pH值的甘氨酸-NaOH缓冲液的配制98
• A3 不同pH值的Tris-HCl缓冲液的配制98-99
• 附录B 三个重组 β-N-乙酰己糖胺酶基因序列99-103
• B1 HL1nag的核酸序列99-100
• B2 JB10nag的核酸序列100-101
• B3 HJ5nag的核酸序列101-103
• 附录C 三个重组 β-N-乙酰己糖胺酶氨基酸序列103-105
• C1 HL1nag的氨基酸序列103
• C2 JB10nag的氨基酸序列103-104
• C3 HJ5nag的氨基酸序列104-105
• 附录D 氨基酸中英文对照及缩写表105

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本文编号：899173