信号放大的乙脑病毒电化学交流阻抗免疫传感器的研究

发布时间：2017-10-01 03:14

  本文关键词：信号放大的乙脑病毒电化学交流阻抗免疫传感器的研究

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【摘要】：自古至今,由病毒引起的疾病严重威胁着人类的健康。其中,由库蚊传播的日本脑炎病毒(JEV)是引起疾病的最严重的病毒之一。它能够侵害人的中枢神经系统,进而引起病毒性脑炎。它在临床上以高热、惊厥、意识障碍及脑膜刺激症为主,病死率很高,且多数幸存者患有神经、认知和精神后遗症。JEV感染主要在我国及亚洲的一些国家流行,是严重的社会公共卫生问题之一。迄今尚无有效的抗病毒药物,针对JEV感染引起的脑炎主要以支持和对症治疗为主。因此,建立一种快速、灵敏的JEV早期诊断方法具有重要的应用价值。JEV感染人体后,在血液中病毒载量较低,经过短暂的病毒血症期后进入脑组织,故需要建立一种高灵敏的方法用于JEV的快速检测。电化学方法因其具有灵敏度高,易于小型化等特点,在生物传感器研究领域广受关注。电化学交流阻抗技术以其对界面性质敏感,免标记等优点受到电化学生物传感器研究人员的青睐。本论文以抗体为分子识别物质,IgM和JEV为目标物,利用辣根氧化物酶HRP作为标记物进行信号放大,开发了一种用于检测IgM和JEV的高灵敏的电化学交流阻抗免疫传感器。本论文由四章内容构成：第一章绪论本章首先概述了JEV研究背景,包括JEV生物学特性、致病机制、防治措施以及传统的检测方法；其次介绍了生物传感器的原理和分类,其中详细综述了生物传感器在病毒检测中的研究；接着概述了电化学免疫传感器的原理和分类,并重点介绍了电化学交流阻抗技术以及该技术在病毒检测中的应用;随后介绍了丝网印刷技术及其在病毒传感器中的研究进展;最后,阐述了本论文的选题背景、研究思路、研究目的以及研究内容。第二章信号放大的电化学免疫传感器检测IgM的研究本研究制备了一种具有高灵敏度的检测IgM的电化学交流阻抗免疫传感器。当目标物IgM存在时,利用三明治夹心法连接上辣根过氧化酶(HRP)标记物。随后在H202的条件下,标记在抗体上HRP催化氧化4-氯-1-萘酚(CN),生成的不溶性沉淀附着在电极表面,阻碍了电子在电化学探针[Fe(CN)6]3/4-与电极表面的传递,进而起到信号放大的作用。通过比较IgM结合前后阻抗值的变化来实现对目标物IgM的检测。在浓度为1.6 fg/mL～1.6 ng/mL的范围内,目标物浓度和阻抗信号表现出良好的线性关系,检测限可达到0.53 fg/mL(S/N=3),并且该传感器有较高的选择性。第三章交流阻抗信号放大的电化学免疫传感器检测JEV的研究本研究构建了一种“三明治”型电化学病毒免疫传感器。首先通过-SH自组装的方式,在处理好的金电极上建立了小分子MUA(十一巯基十一烷酸)、MCH(巯基己醇)和DTT(二硫苏糖醇)的混合单层。之后利用NHS/EDC活化MUA上的羧基,并和抗体上的氨基发生缩合反应形成酰胺键,将1st anti-JEV固定在电极上。随后利用免疫反应把自制的JEV和2nd HRP-anti-JEV连接到电极上。在H202存在的条件下HRP催化氧化CN产生沉淀吸附在电极表面,使电极导电性降低。最后用电化学交流阻抗方法来检测电极上沉淀物的积累,进而实现对目标物JEV的检测及信号放大。该方法有很高的灵敏度和选择性。第四章基于金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极的电化学交流阻抗免疫传感器检测JEV的研究本研究以金纳米粒子(AuNPs)修饰的丝网印刷碳电极(SPCE)为基体电极,制备了一种便宜、高灵敏的电化学免疫传感器用于JEV的研究。首先,利用计时电位法在SPCE上电沉积一层AuNPs;之后通过-SH自组装的方式,在金纳米粒子上建立了小分子MUA、MCH和DTT的混合单层。之后再利用NHS/EDC活化MUA上的-COOH,并与anti-JEV上的-NH2发生缩合反应形成酰胺键,将1 stanti-JEV固定在电极上。通过三明治夹心法将HRP标记的二抗结合到电极表面。最后HRP生物催化氧化CN产生不溶物沉淀,阻碍氧化还原电对与电极之间的电子传递,实现了JEV的高灵敏度检测。在JEV浓度为500 pfu/mL-500000 pfu/mL范围内,阻抗变化值与JEV的浓度呈现良好的线性关系,最低检测限为167 pfu/mL(S/N=3),为JEV的检测提供了一种低成本、高灵敏、选择性好的方法。
【关键词】：免疫传感器 电化学交流阻抗 丝网印刷电极 JEV 信号放大
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第1章 绪论11-31
• 1.1 JEV概述11-15
• 1.1.1 JEV的生物学特性12
• 1.1.2 JEV的致病机制及临床表现12-13
• 1.1.3 JEV的防治13
• 1.1.4 JEV传统的检测方法13-15
• 1.2 生物传感器的概述15-21
• 1.2.1 生物传感器的工作原理15-16
• 1.2.2 生物传感器的分类16-17
• 1.2.3 生物传感器在病毒检测中的研究进展17-21
• 1.3 电化学免疫传感器的概述21-25
• 1.3.1 电化学免疫传感器的原理21-22
• 1.3.2 电化学交流阻抗技术的概述22-24
• 1.3.3 电化学交流阻抗免疫传感器在病毒检测中的应用24-25
• 1.4 丝网印刷传感器25-28
• 1.4.1 丝网印刷技术的概述25-26
• 1.4.2 丝网印刷技术在病毒传感器中的应用26-28
• 1.5 本论文的选题背景、研究思路、研究目的和研究内容28-31
• 第2章 信号放大的电化学免疫传感器检测IgM的研究31-43
• 2.1 引言31-32
• 2.2 实验部分32-35
• 2.2.1 试剂32-33
• 2.2.2 仪器33
• 2.2.3 电化学IgM免疫传感器的制备33-35
• 2.3 结果与讨论35-41
• 2.3.1 电化学IgM免疫传感器的表征35-38
• 2.3.2 IgM免疫传感器的原子力显微镜的表征38
• 2.3.3 电化学IgM免疫传感器的线性范围38-39
• 2.3.4 电化学IgM免疫传感器的选择性39-41
• 2.4 本章小结41-43
• 第3章 交流阻抗信号放大的电化学免疫传感器检测JEV的研究43-53
• 3.1 引言43-44
• 3.2 实验部分44-46
• 3.2.1 试剂44
• 3.2.2 仪器44
• 3.2.3 电化学JEV免疫传感器的制备44-46
• 3.3 结果与讨论46-52
• 3.3.1 电化学JEV免疫传感器的交流阻抗法表征46-48
• 3.3.2 电化学JEV免疫传感器的线性范围48-50
• 3.3.3 电化学JEV免疫传感器的选择性50-52
• 3.4 结论52-53
• 第4章 基于金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极的电化学交流阻抗免疫传感器检测JEV的研究53-69
• 4.1 引言53-54
• 4.2 实验部分54-58
• 4.2.1 试剂54-55
• 4.2.2 仪器55
• 4.2.3 丝网印刷碳电极(SPCE)的制备55-56
• 4.2.4 AuNPs-SPCE的制备56
• 4.2.5 电化学JEV免疫传感器的制备56-58
• 4.3 结果与讨论58-68
• 4.3.1 印制的SPCE的形貌58
• 4.3.2 AuNPs-SPCE的电化学表征58-60
• 4.3.3 JEV免疫传感器的交流阻抗表征60-62
• 4.3.4 电化学JEV免疫传感器的条件优化62-63
• 4.3.5 JEV免疫传感器的原子力显微镜的表征63-64
• 4.3.6 电化学JEV免疫传感器的线性范围64-66
• 4.3.7 检测JEV电化学免疫传感器的选择性66-68
• 4.4 本章小结68-69
• 总结69-71
• 参考文献71-85
• 致谢85-87
• 攻读硕士期间的研究成果87

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本文编号：951989