壳寡糖的制备、分离纯化及生物活性研究

发布时间：2017-10-03 08:28

  本文关键词：壳寡糖的制备、分离纯化及生物活性研究

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【摘要】：壳聚糖来源于虾、蟹壳,是甲壳素脱乙酰化的产物,由一定比例的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖经β-(1,4)糖苷键连接而成,分子量大且不溶于水,限制了其在多方面的应用。壳寡糖是壳聚糖的降解产物,分子量小,水溶性好,易被人体吸收,与壳聚糖相比具有更显著的生物活性。然而由于高纯度的壳寡糖单体难以制备,以往的研究中均采用壳寡糖混合物进行生物活性评价,这限制了其生物活性机理的深入研究。因此,特定聚合度壳寡糖的制备及其生物活性研究对于深入开发利用壳寡糖是非常必要的。本文采用酶解法制备壳寡糖,并采用凝胶色谱法对壳寡糖进行分离纯化获得了单一聚合度壳寡糖,并在此基础上对其体内降血脂和体外抗氧化活性进行了研究。论文的主要研究结果如下:(1)壳寡糖的制备:以壳聚糖为原料,还原糖得率为指标,采用单因素和正交试验优化了壳聚糖酶解制备壳寡糖的工艺条件,并对正交优化条件下制备的壳寡糖的分子量、组成和各组分含量等进行了检测。结果表明,壳寡糖的最佳水解条件是:温度为50℃,pH为5.6,加酶量为58 U?g-1,底物浓度为3.0%,反应时间为4.0 h。该条件下降解制备壳寡糖,乙酰丙酮法测得其数均分子量为1457 Da,DNS法测得其含量为96.5%,TLC和HPLC法测得其含有氨基葡萄糖,壳2糖,壳3糖,壳4糖和壳5糖,其中,以壳3糖和壳4糖为主。HPLC法定量结果表明,氨基葡萄糖、壳2糖、壳3糖、壳4糖、壳5糖含量分别为1.24%、12.83%、40.42%、33.04%和12.46%。(2)壳寡糖的分离纯化:采用凝胶色谱法对壳寡糖进行分离纯化,固定柱床体积340 mL(2.0×110 cm),考察了上样量和洗脱流速,确定最适上样量为0.10 g,流速为0.20 mL?min-1。此条件下分离纯化得到四个壳寡糖单体:壳2糖、壳3糖、壳4糖和壳5糖。HPLC法检测其纯度分别为95.7%,97.1%,97.7%和89.4%。(3)壳寡糖体内降血脂活性:壳寡糖数均分子量为1457 Da,聚合度为1~5,含量为96.5%。通过饲喂高脂饲料构建高血脂SD大鼠模型,灌胃给药6周后,测定高(375 mg?kg-1?d-1)、中(187.5 mg?kg-1?d-1)、低(93.75 mg?kg-1?d-1)剂量组的降血脂作用效果。结果表明,壳寡糖高、中剂量组均能显著降低血清中TC、TG和LDL-C水平,升高HDL-C水平,表明壳寡糖具有良好的降血脂活性。此外壳寡糖高、中剂量组均能显著升高肝脏中脂蛋白酯酶和肝脂酶活性,降低肝系数,改善脂肪肝症状,说明壳寡糖具有很好的保肝护肝作用。且壳寡糖还能使血清中SOD和GSH-Px活力显著升高,MDA显著减少,表明壳寡糖还能够增强机体的抗氧化活性。(4)壳2~5糖单体的体外降血脂和抗氧化活性:选用人肝癌细胞HepG2作为研究对象,用20μg?mL-1胆固醇构建高胆固醇模型和50%血清构建高甘油三酯模型,研究不同浓度壳2~5糖对细胞内胆固醇和甘油三酯的影响。结果表明,随着聚合度的增大,其降低胆固醇和甘油三酯的作用逐渐减弱,即壳2糖壳3糖壳4糖壳5糖。对DPPH和超氧阴离子的清除实验表明,其清除作用随聚合度增大而增大。对?OH的清除作用则相反。综上,本文对壳寡糖的制备、分离纯化及体内体外降血脂和抗氧化活性进行了研究,为壳寡糖功能产品的开发奠定了基础,也为壳寡糖的进一步开发利用提供科学依据。
【关键词】：壳寡糖 分离纯化 降血脂活性 抗氧化活性
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O636.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 引言10-22
• 1.1 壳寡糖概述10-11
• 1.2 壳寡糖的制备与检测方法11-15
• 1.2.1 壳寡糖的制备11-13
• 1.2.2 壳寡糖的检测13-15
• 1.3 壳寡糖单体15-17
• 1.3.1 壳寡糖单体的制备15-16
• 1.3.2 壳寡糖单体活性的研究16-17
• 1.4 壳寡糖的应用17-19
• 1.4.1 壳寡糖在生物医药领域中的应用17-18
• 1.4.2 壳寡糖在农业领域中的应用18
• 1.4.3 壳寡糖在精细化工领域中的应用18-19
• 1.5 本论文研究意义、目标和内容19-22
• 1.5.1 本论文研究的意义19
• 1.5.2 本论文的研究目标19-20
• 1.5.3 本论文的研究内容20-22
• 第2章 壳寡糖的制备与表征22-40
• 2.1 实验材料与仪器22-24
• 2.1.1 实验材料22-23
• 2.1.2 实验仪器23-24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 壳聚糖酶解制备壳寡糖条件的确定24
• 2.2.2 正交试验24-25
• 2.2.3 壳寡糖的制备25
• 2.2.4 壳寡糖的检测25-28
• 2.3 结果与讨论28-39
• 2.3.1 壳聚糖酶解制备壳寡糖条件的确定28-32
• 2.3.2 正交试验32-33
• 2.3.3 壳寡糖的检测33-36
• 2.3.4 壳寡糖的定量分析36-39
• 2.4 本章小结39-40
• 第3章 壳寡糖的分离纯化及检测40-50
• 3.1 材料与仪器40-41
• 3.1.1 材料与试剂40-41
• 3.1.2 仪器与设备41
• 3.2 实验方法41-42
• 3.2.1 壳寡糖的分离与纯化步骤41-42
• 3.2.2 壳寡糖分离纯化条件的考察42
• 3.2.3 壳寡糖单体的检测42
• 3.3 实验结果与分析42-48
• 3.3.1 壳寡糖的分离42-45
• 3.3.2 壳寡糖单体纯度的检测45-47
• 3.3.3 讨论47-48
• 3.4 本章小结48-50
• 第4章 壳寡糖体内降血脂实验研究50-60
• 4.1 实验材料与仪器50-52
• 4.1.1 实验材料50-51
• 4.1.2 实验仪器51-52
• 4.2 实验方法52-53
• 4.2.1 高脂饲料52
• 4.2.2 高脂血症模型的建立52
• 4.2.3 实验动物的分组52-53
• 4.2.4 数据统计分析53
• 4.3 结果与讨论53-58
• 4.3.1 壳寡糖对大鼠血清血脂水平的影响53-54
• 4.3.2 壳寡糖对大鼠肝脂水平的影响54-55
• 4.3.3 壳寡糖对大鼠肝指标的影响55
• 4.3.4 壳寡糖对大鼠抗氧化活性的影响55-56
• 4.3.5 壳寡糖对大鼠肝脏病理形态的影响56-58
• 4.4 本章小结58-60
• 第5章 壳寡糖单体体外降血脂和抗氧化实验研究60-76
• 5.1 材料与仪器60-63
• 5.1.1 实验材料60-61
• 5.1.2 实验仪器61-62
• 5.1.3 主要试剂的配制62-63
• 5.2 实验方法63-66
• 5.2.1 壳寡糖单体体外降血脂活性的测定63-65
• 5.2.2 壳寡糖单体体外抗氧化活性的测定65-66
• 5.3 结果与分析66-73
• 5.3.1 体外降血脂活性66-71
• 5.3.2 体外抗氧化活性71-73
• 5.4 本章小结73-76
• 第6章 结论与展望76-78
• 6.1 结论76-77
• 6.2 展望77-78
• 参考文献78-86
• 致谢86-88
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果88

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本文编号：964206