通过定向进化和半理性设计提高顺式环氧琥珀酸水解酶的热稳定性的研究

发布时间：2017-10-04 00:32

  本文关键词：通过定向进化和半理性设计提高顺式环氧琥珀酸水解酶的热稳定性的研究

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【摘要】：顺式环氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase)是一种环氧化物水解酶(sEHs, EC 3.3.2.10)。其功能是不借助辅因子或金属离子催化环氧琥珀酸的环氧键的水解,形成特定手性的酒石酸。本文研究的顺式环氧琥珀酸水解酶催化产生L(+)-酒石酸。此类cis-epoxysuccinate hydrolase (CESH)存在于多种微生物体内,如根瘤菌(Rhizobium)、假单胞菌(Pseudomonas)、诺卡式菌(Nocardia)、棒状杆菌(Corynebacterium)和红球菌(Rhodococcus)。CESH在工业上得到了应用,其优点在于催化效率高,立体选择性好。但目前工业生产所用的CESH自身的稳定性差,催化剂的使用寿命较短,提高CESH的稳定性可以进一步提高工业生产的效率。本研究选取目前工业生产所使用的来自红球菌(Rhodococcus)顷式环氧琥珀酸水解酶,经过密码子优化后合成该基因(GenBank DQ471957),构建重组质粒pET8a(+)-CESH;转入宿主菌E. coli BL21(DE3),构建工程菌E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-CESH;使用IPTG诱导表达,分析其活性及热稳定性。野生型CESH的比活力为76.5 U/mg,其50℃下的半衰期(t1/2,50℃)为8.5 mmin,其T5015(酶在该温度下15 mmin内丧失50%活力)为44.0℃。设计了针对该酶热稳定性的高通量筛选方法,优化了易错PCR的反应条件。经定向进化改造,得到一株突变体1X-1(Q122R),比活力为75.8 U/mg,t1/2,50℃为31.6 min,T5015为49.5℃。在此基础上,以突变体1X-1为母本进行进一步的定向进化改造,均未能得到更好的突变体有益突变,改造受阻。因此,研究转向选择半理性设计思路对CESH进行进一步的改造。以突变体1X-1为母本,利用“多重序列对比”手段预测可能对蛋白质热稳定性有利的氨基酸替换方式,得到两株热稳定性较高的突变子,2X-2(Q122R,F26V)釉2X-4(Q122R, I83R)。突变体2X-2的比活力为76.1 U/mg,t1/2,50℃为162.1 min, T5015为54.6℃。突变体2X-4的比活力为74.3 U/mg, t1/2,50℃为44.0 min,T5015为50.4℃。利用定点突变将突变体2X-2和2X-4的突变位点结合在一起,得到突变体3X (Q122R,F26V, I83R),其比活力为75.5 U/mg,t1/2,50℃为170.8 min, T5015为55.4℃。以突变体3X为母本,利用“计算机模拟突变”预测能提高其热稳定性的氨基酸替换方式,得到了具有更高热稳定性的两株突变体,4X-4 (Q122R, F26V, I83R, D8K)和4X-6 (Q122R, F26V, I83R, S90R)。突变体4X-1的比活力为75.8 U/mg,t1/2,50℃为225.2 min,死015为61.6℃。突变体4X-6的比活力为75.2 U/mg, t1/2,50℃为180.5 min, T5015为56.5℃。将突变体4X-1和4X-6的突变位点结合在一起,得到了突变体5X (Q122R, F26V, I83R,D8K, S90R),其比活力为74.3 U/mg, t1/2,50℃为237.1 min, T5015为62.4℃。以突变体5X为母本,在其8位点,26位点,83位点,90位点和122位点上分别进行定点饱和突变,筛选出一株带有更高热稳定性的突变体5X-1 (Q122R, F26W, I83R, D8K, S90R),其比活力为75.1 U/mg, t1/2, 50℃为293.2 min,T5015为64.8℃。相较于野生型CESH,突变体5X-1的催化效率没有明显下降,并且具有极高的热稳定性和酸碱耐受性。突变体5X-1在50℃下酶活力的半衰期提高了33.5倍,T5015则提高了20℃；最适pH值范围则由野生型的8.0-9.0扩展到了5.0-10.0,大大提高了酶的pH值耐受性。另外,将突变体5X-1固定化后所得的生物催化剂的活力较固定化野生酶提高了一倍；并且固定化野生型CESH在37℃,45℃和50℃下的半衰期分别是13天,5天和2天,而固定化突变子5X-1的半衰期在50℃和45℃下分别为25天和35天,在37℃下反应38天后仍残余65%的活力,使用寿命得到了极大的延长。
【关键词】：顺式环氧琥珀酸水解酶 重组大肠杆菌 定向进化 半理性设计
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 文献综述12-28
• 1.1 引言12-17
• 1.1.1 L(+)-酒石酸生产方式12-13
• 1.1.2 酶催化法的研究进展13-15
• 1.1.3 顺式还氧琥珀酸水解酶的可溶性表达15
• 1.1.4 顺式还氧琥珀酸水解酶的适宜温度15-16
• 1.1.5 提高CESH的热稳定性16-17
• 1.2 定向进化17-21
• 1.2.1 定向进化技术的原理17-18
• 1.2.2 定向进化的思路18
• 1.2.3 建立突变文库18-21
• 1.2.4 建立高通量筛选方法21
• 1.3 半理性设计21-26
• 1.3.1 基于结构信息的靶向随机突变22-25
• 1.3.2 基于蛋白质序列同源性的改造25-26
• 1.4 课题研究的研究思路26-28
• 第二章 实验材料与方法28-42
• 2.1 菌种和质粒28-29
• 2.2 仪器和工具29-31
• 2.2.1 主要仪器29
• 2.2.2 工具酶及主要试剂29-31
• 2.3 培养基和培养条件31
• 2.3.1 定点突变和酶活性测定所用31
• 2.3.2 定向进化所用31
• 2.4 实验分析方法31-42
• 2.4.1 pH值的测定31
• 2.4.2 菌体浓度测定31
• 2.4.3 琼脂糖凝胶电泳31-32
• 2.4.4 质粒的提取32-33
• 2.4.5 大肠杆菌超声破碎方法33
• 2.4.6 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳实验33-35
• 2.4.7 蛋白的纯化35-36
• 2.4.8 蛋白浓度的测定36
• 2.4.9 CESH酶学性质的测定36-37
• 2.4.10 感受态细胞的制备和转化37-42
• 第三章 顺式环氧琥珀酸水解酶CESH表达体系优化42-54
• 3.1 引言42
• 3.2 实验方法42-44
• 3.2.1 菌株和质粒42
• 3.2.2 基本培养条件42-43
• 3.2.3 工具酶及主要试剂43
• 3.2.4 质粒DNA的提取43
• 3.2.5 DNA的检测以及切胶回收43
• 3.2.6 重组质粒的构建43-44
• 3.2.7 构建重组菌44
• 3.3 结果与讨论44-52
• 3.3.1 CESH结构基因的密码子优化44-45
• 3.3.2 构建重组质粒45-46
• 3.3.3 重组质粒pET28a(+)-CESH的构建46-47
• 3.3.4 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-CESH的构建47-49
• 3.3.5 摇瓶中不同重组菌诱导条件优化及比较49-51
• 3.3.6 96孔板中工程菌培养、诱导条件的优化51-52
• 3.4 小结52-54
• 第四章 顺式环氧琥珀酸水解酶CESH的定向进化54-66
• 4.1 引言54
• 4.2 菌株、质粒和酶54-55
• 4.3 建立突变率稳定的突变文库55-60
• 4.3.1 不同PCR循环下的突变率控制55-56
• 4.3.2 使用无自检能力的Taq聚合酶56-59
• 4.3.3 使用高保真Pfu聚合酶59-60
• 4.4 感受态细胞的选择60-62
• 4.5 高通量筛选62-64
• 4.6 小结64-66
• 第五章 顺式环氧琥珀酸水解酶CESH的半理性设计66-78
• 5.1 引言66
• 5.2 基于MSAs的设计与改造66-68
• 5.3 基于同源模建的设计与改造68-71
• 5.3.1 CESH同源模建68-70
• 5.3.2 计算机模拟突变70-71
• 5.4 定点饱和突变71-74
• 5.5 突变子5x-1的性质分析74-77
• 5.5.1 突变子5X-1环境抗逆性74-75
• 5.5.2 固定化下突变子5X-1和野生型CESH的比较75-77
• 5.6 小结77-78
• 第六章 总结和展望78-80
• 6.1 总结78-79
• 6.2 展望79-80
• 参考文献80-88
• 攻读硕士学位论文期间研究成果88
• 已发表论文88
• 申报专利88

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8 沈，

本文编号：967650