多肽与寡核苷酸偶联纯化方法及功能化寡核苷酸的应用研究

发布时间：2017-10-07 16:04

  本文关键词：多肽与寡核苷酸偶联纯化方法及功能化寡核苷酸的应用研究

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【摘要】：寡核苷酸是一类短链核苷酸,其具有很强的生物活性。通过指数富集的配基进化(SELEX)技术筛选出能与蛋白、小分子、离子、细胞等受体特异性结合的寡核苷酸具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于各种生物传感。同时,寡核苷酸可作为基因治疗药物或药物前体。但寡核苷酸具有细胞通透性差、易被分解且与目标物亲和力不强的缺点。而多肽具有分子量小,带电量可调,抗酶水解等特点,将两者进行偶联既可以提高细胞的通透性还可以提高寡核苷酸的生物活性。近年来各种多肽筛选技术尤其是噬菌体展示技术的发展,使得一大批具有识别、检测和治疗癌细胞功能的多肽不断出现。这些多肽的发现给各种癌症的诊断、治疗带来了新的思路和方法。将多肽与寡核苷酸进行有效地连接,可得到具有双功能的生物分子,或具有协同治疗作用能实现诊疗一体化的药物。故多肽与寡核苷酸的偶联物(POCs),在生物传感和癌症治疗方面都具有很高的实际应用价值。基于以上原因,本文开展了以下的工作：1、利用了Click反应,EDC-NHS交联羧基与巯基的直接偶联法和偶联剂N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP),4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-SMCC)偶联的方法合成了不同性质的多肽与寡核苷酸的偶联物,在合成过程中对合成各条件进行优化和改进,来提高反应效率。从理论和实践中探讨对合成效率有关键性影响的因素。讨论了不同偶联方法在合成多肽与寡核苷酸偶联物中的优缺点,并指出各种方法适用范围及最适的反应条件。2、为了寻求一种快速、高效、规模化、标准化分离提纯多肽与寡核苷酸偶联物的方法,我们利用高效液相色谱(HPLC)、离子交换色谱(IEC)、聚丙烯酰胺凝胶切胶回收、透析、超滤、核酸酶酶切等方法将合成好的混合物进行提纯,针对各种提纯方法的特点进行讨论并将其用于改进纯化过程。对纯化过程中遇到的各种问题进行分析和讨论,总结给出了各种分离方法的优缺点。最后,结合实验原理和结果对各种方法的适用条件和范围给出了合理的建议。该结果对以后纯化不同POCs给出了明确的指导和建议。3、利用一条带有BHQ1荧光淬灭基团的DNA与对Pb~(2+)具有特异性的DNA酶链进行互补配对,当无Pb~(2+)存在时向溶液中加入超电荷绿色荧光蛋白(scGFP)。由于正负电荷的吸引作用scGFP与DNA双链靠近,绿色荧光蛋白的荧光被BHQ1淬灭。当存在Pb~(2+)时,Pb~(2+)能特异性识别DNA双链中含有RNA的位点并将其切割,切割后的含有BHQ1的短链DNA从双链上脱离并游离到溶液,此时再加入scGFP,游离到溶液中的BHQ1无法淬灭scGFP的荧光导致scGFP的荧光恢复。实现了一种荧光"turn on"的Pb~(2+)响应的平台,并用于高效检测Pb~(2+)。
【关键词】：寡核苷酸 多肽 偶联 纯化 Pb~(2+)特异性DNA酶 超电荷绿色荧光蛋白
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q52;O652
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-26
• 1.1 多肽-寡核苷酸偶联12-17
• 1.1.1 片段合成法13-16
• 1.1.2 固相逐步合成法16-17
• 1.1.3 生化-酶偶联合成法17
• 1.2 多肽-寡核苷酸分离提纯17-19
• 1.2.1 基于色谱法的分离17-18
• 1.2.2 基于电泳法的分离18-19
• 1.3 多肽-寡核苷酸偶联物的应用19-24
• 1.3.1 在治疗方面的应用19-23
• 1.3.2 作为模型进行机理研究23-24
• 1.3.3 作为人工酶24
• 1.4 本文构思24-26
• 第2章 多肽与寡核苷酸偶联方法的研究26-39
• 2.1 前言26-28
• 2.2 实验部分28-30
• 2.2.1 实验试剂与设备28-29
• 2.2.2 通过叠氮基与炔基的方法合成POCs29
• 2.2.3 通过EDC-NHS的方法合成POCs29
• 2.2.4 通过交联剂SPDP的方法合成POCs29
• 2.2.5 通过交联剂Sulfo-SMCC的方法合成POCs29
• 2.2.6 紫外-分光光度法初步测定DNA浓度29-30
• 2.2.7 变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶分析偶联产物30
• 2.3 结果与讨论30-37
• 2.3.1 各类合成条件的优化30-36
• 2.3.2 各类合成方法的优缺点36-37
• 2.4 本章小结37-39
• 第3章 多肽与寡核苷酸偶联物分离方法的研究39-51
• 3.1 前言39
• 3.2 实验部分39-41
• 3.2.1 实验仪器与试剂39-40
• 3.2.2 反向高效液相色谱法用于POCs的分离40
• 3.2.3 离子交换色谱法用于POCs的分离40
• 3.2.4 凝胶电泳法用于POCs的分离40-41
• 3.2.5 透析的方法用于POCs的分离41
• 3.2.6 超滤的方法用于POCs的分离41
• 3.2.7 核酸酶水解方法用于POCs的分离41
• 3.3 结果与讨论41-50
• 3.3.1 反向高效液相色谱方法在分离POCs中的条件分析和优化41-43
• 3.3.2 离子交换色谱方法在分离POCs中的条件分析和优化43-45
• 3.3.3 凝胶电泳方法在分离POCs中的条件分析和优化45-46
• 3.3.4 透析方法分离在POCs中的条件分析和优化46
• 3.3.5 超滤方法在分离POCs的条件分析和优化46-47
• 3.3.6 核酸水解方法在分离POCs中的条件分析和优化47-48
• 3.3.7 以上纯化方法的比较和总结48-50
• 3.4 本章小结50-51
• 第4章 基于超电荷绿色荧光蛋白与DNA酶高选择荧光检测Pb~(2+)51-60
• 4.1 前言51-52
• 4.2 实验部分52-53
• 4.2.1 实验仪器与试剂52
• 4.2.2 酶切反应52
• 4.2.3 荧光检测52-53
• 4.2.4 变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶分析酶切效率53
• 4.3 实验结果与讨论53-58
• 4.3.1 DNAzyme与scGFP平台检测Pb~(2+)实验原理53-54
• 4.3.2 DNAzyme与scGFP平台用于检测Pb~(2+)的可行性分析54-55
• 4.3.3 DNA长度的优化55
• 4.3.4 酶切体系的优化55-56
• 4.3.5 检测体系的优化56-57
• 4.3.6 不同Pb~(2+)浓度的响应57
• 4.3.7 scGFP-DNAzymes平台对Pb~(2+)响应的选择性57-58
• 4.3.8 scGFP-DNAzymes平台用于实际样品中Pb~(2+)的检测58
• 4.4 小结58-60
• 结论60-61
• 参考文献61-73
• 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录73-74
• 致谢74-75

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本文编号：988764