G蛋白偶联受体GPR17同源二聚作用的研究

发布时间：2017-10-09 05:26

  本文关键词：G蛋白偶联受体GPR17同源二聚作用的研究

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【摘要】：G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor, GPCR)是一大类与G蛋白偶联的膜蛋白受体的统称。它们均包含有7个跨膜a螺旋,在它们的C-端和连接第5和第6个跨膜螺旋的胞内loop上都有与G蛋白结合的位点。GPCRs与细胞周围环境中的相应配体结合,可通过多种途径激活细胞内的一系列信号通路,最终参与调节细胞的功能。GPCRs与许多疾病密切相关,尤为重要的是,目前大约40%的临床药物都以GPCRs作为靶点。然而,我们对GPCRs的了解还极为缺乏,尤其是关于GPCRs的结构、构象变化、以及非G蛋白偶联的作用机制,尚处于研究的起始阶段,对这些作用的研究可促进我们对GPCRs的了解。GPCRs的作用机制包括：(1)激活相应的G蛋白,激活一系列信号通路,这是GPCRs经典的信号通路；(2)通过受体内化,受体内化的机制和生物学意义由于研究方法相对成熟,近年来已经获得了许多进展和认识；(3)通过受体之间的同源或者异源二聚化,由于研究手段较为缺乏,虽然有一定的报道,研究者初步证明GPCRs能够形成同源或异源二聚体,还解析了一部分二聚体的结构,发现二聚体形成能够改变受体的功能,但对二聚体形成的机制和生物学意义还知之甚少。甚至还有人认为GPCRs不会发生二聚化,所谓的二聚化只是研究过程中,由于现有研究手段都需要在细胞内转染相应的受体,导致受体在细胞内过表达所产生的“假象”。研究GPCRs二聚化的主要技术包括生化技术(如免疫共沉淀、化学交联结合免疫印迹法等),荧光分析技术(如单分子荧光、荧光共振能量转移、荧光寿命成像-荧光共振能量转移等),以及X射线晶体衍射技术等。其中,荧光寿命成像-荧光共振能量转移(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy-Fluorescence Resonance Energy Transfer, FLIM-FRET)是一种基于供体的荧光寿命变化,来研究蛋白质相互作用的新型荧光成像技术。相比于传统FRET技术,FLIM-FRET不受激发光强度、荧光团浓度、光漂白、供体与受体激发光谱重叠等因素的影响,因此在GPCRs二聚化的研究中有着较大的优势。G蛋白偶联受体17(GPR17)是一种P2Y样受体,主要分布在脑内、肾脏、心脏和血管内皮等易受缺血再灌注损伤的器官。GPR17参与许多生理病理过程,如脑损伤、脊髓损伤、少突胶质细胞发育及成熟,因此它具有成为相关疾病治疗靶点的巨大潜能。近年来,人们开展了一系列对GPR17受体的研究。其中,关于GPR17的结构,GPR17是否存在同源或异源二聚体,尚不清楚。因此,本论文拟采用FLIM-FRET技术研究GPR17是否存在同源二聚体,并解析其同源二聚体的构象。本论文首先在HEK 293T细胞,采用绿色荧光蛋宀(Green Fluorescent Protein, GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)作为FRET的荧光供体和受体,mCherry采用融合表达技术,以基因工程的方法插入到GPR17的N-端或者细胞内第三个bop(E255后),通过同样的策略可以把GFP融合到GPR17的N-端或者细胞内第三个bop(E255后)。此外,采用实验室近期发展的‘切割"GFP标记策略,增加了三个GFP的标记位点,最后成功获得五组可以用于FRET检测的荧光供体和受体对(Donor-Acceptor pair);通过细胞内钙成像实验,我们研究了荧光蛋白标记对GPR17功能的影响；采用FLIM-FRET技术,我们测量了五对荧光供体和受体之间的FRET效率,并且计算了各荧光供体和受体之间的距离；在二聚化构象计算时,我们首先采用同源建模,结合I-TASSER软件,构建了GPR17单体的结构；然后结合五组荧光供体和受体对之间的距离,构建了GPR17同源二聚体的结构；基于GPR17的氨基酸序列,在PDB数据库中,我们找到了与GPR17同源性最好的64个GPCRs的同源二聚体的结构,通过比对,我们发现其中12个GPCRs的二聚体结构与我们预测的GPR17同源二聚体结构具有相似的作用界面。在后续的研究中,我们将通过突变GPR17二聚化界面的氨基酸,来促进／抑制GPR17的同源二聚化,进一步阐明GPR17二聚化的生物学意义。就荧光标记方法学而言,本论文除了发展了一种在细胞水平上对GPR17进行多位点荧光标记的方法外,还发展了另外两种蛋白质定点荧光标记的方法——基于镧系金属结合有机配体的荧光探针(tpy-Tb3+;和tpy-Eu3+)和基于疏水性相互作用的罗丹明101内盐(Rhodamine 101 inner salt, Rh101)染料探针。其中,tpy-Tb3+:和tpy-Eu3+的特点在于：stoke位移大,能有效避免探针的自淬灭和激发波长对荧光检测狭缝的散射光干扰,荧光寿命长,探针立体位阻小等。Rh101的特点在于：量子产率高,与蛋白质结合强度大(纳摩尔级别),光谱位于长波长区域,适用于活体检测。综上所述,本论文基于不同的荧光蛋白定点标记策略,采用FLIM-FRET技术,发现GPR17能够形成同源二聚体,并结合计算和模拟获得了其同源二聚体的模型。此外,本论文发展了蛋白质定点荧光标记的方法,在后续的研究过程中,它们将用于解答更多的生物学问题。
【关键词】：G蛋白偶联受体17 荧光蛋白 二聚化 荧光寿命成像-荧光共振能量转移 镧系金属 罗丹明
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 1 引言15-27
• 1.1 G蛋白偶联受体及研究的科学意义15
• 1.2 G蛋白偶联受体二聚化的研究概况15-19
• 1.2.1 G蛋白偶联受体二聚化的研究现状15-16
• 1.2.2 研究GPCRs二聚化的常用方法介绍16-19
• 1.3 GPCRs单体同源建模的简介19-20
• 1.4 蛋白质定点荧光标记技术的介绍20-23
• 1.4.1 小分子荧光探针的标记20-21
• 1.4.2 荧光蛋白质的标记21-23
• 1.5 荧光光谱技术介绍23-27
• 1.5.1 荧光的基本原理23-24
• 1.5.2 荧光的基本特征24-25
• 1.5.3 FLIM-FRET技术的介绍25-27
• 2 细胞水平GPR17的多位点荧光蛋白标记27-49
• 2.1 引言27-28
• 2.2 材料和方法28-39
• 2.2.1 蛋白质氨基酸序列28-32
• 2.2.2 药物和试剂32
• 2.2.3 实验仪器32-33
• 2.2.4 溶液配制33-34
• 2.2.5 实验方法34-39
• 2.3 结果与讨论39-47
• 2.3.1 荧光蛋白的荧光光谱扫描39
• 2.3.2 细胞水平上GPR17的荧光标记39-45
• 2.3.3 GFP标记对GPR17功能的影响45-47
• 2.4 结论47-49
• 3 基于FLIM-FRET技术检测GPR17的同源二聚化49-71
• 3.1 引言49-50
• 3.2 材料和方法50-61
• 3.2.1 蛋白质氨基酸序列50-54
• 3.2.2 药物和试剂54-55
• 3.2.3 实验仪器55
• 3.2.4 溶液配制55-56
• 3.2.5 实验方法56-61
• 3.3 结果与讨论61-70
• 3.3.1 GPR17/G128：GFP10-11+GFP1-9体系中供体的寿命统计61-62
• 3.3.2 GPR17/R214：GFP10-11+GFP1-9体系中供体的寿命统计62-63
• 3.3.3 GPR17/R291：GFP10-11+GFP1-9体系中供体的寿命统计63-64
• 3.3.4 GPR17/N：GFP体系中供体的寿命统计64-65
• 3.3.5 GPR17/E255：GFP体系中供体的寿命统计65-66
• 3.3.6 GPR17分子间FRET效率与距离的计算66-67
• 3.3.7 GPR17单体结构的同源建模与分子模拟67-68
• 3.3.8 GPR17同源二聚体模型的搭建68-69
• 3.3.9 GPR17同源二聚体结构在PDB数据库中的比对69-70
• 3.4 结论70-71
• 4 基于镧系金属络合物的荧光探针的研究71-81
• 4.1 引言71-73
• 4.2 材料和方法73-75
• 4.2.1 样品制备73-74
• 4.2.2 荧光光谱扫描实验74
• 4.2.3 荧光滴定实验74-75
• 4.3 结果与讨论75-79
• 4.3.1 tpy-Tb~(3+)和tpy-Eu~(3+)的荧光光谱扫描75-76
• 4.3.2 tpy-Tb~(3+)与Ub的结合76-77
• 4.3.3 tpy-Eu~(3+)与Ub的结合77-79
• 4.4 结论79-81
• 5 基于疏水性相互作用的Rh101探针研究81-91
• 5.1 引言81-82
• 5.2 材料和方法82-85
• 5.2.1 样品制备82-84
• 5.2.2 Rh101的荧光光谱扫描实验84
• 5.2.3 荧光滴定实验84-85
• 5.3 结果与讨论85-88
• 5.3.1 Rh101的荧光光谱扫描85-86
• 5.3.2 WT Ub和Rh101的结合86-87
• 5.3.3 Ub/L8：tag与Rh10结合87-88
• 5.3.4 Ub/L8：tag和WT Ub与Rh101结合情况的比较88
• 5.4 结论88-91
• 6 总结与展望91-95
• 6.1 GPR17在细胞水平上的多位点荧光标记91
• 6.2 GPR17在细胞水平上存在同源二聚化现象91-92
• 6.3 GPR17同源二聚体结构的预测92
• 6.4 用于蛋白质定点标记的荧光探针研究92-93
• 6.5 展望93-95
• 参考文献95-101
• 附录A 荧光光谱检测101-103
• 附录B 激光共聚焦荧光显微镜的拍摄103-105
• 附录C 荧光寿命成像(FLIM)拍摄105-109
• 附录D 用于磁共振研究的赖氨酸甲基化修饰方法109-112
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果112

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