共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL

发布时间：2017-01-04 19:18

  本文关键词：转基因生物安全监管模式及我国转基因生物安全立法研究，由笔耕文化传播整理发布。

《扬州大学》 2014年

共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-6基因重组鸡痘病毒的生物安全评价

娄亚坤  

【摘要】：禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)已成为危害养殖业、公共卫生的重要病原之 灭活疫苗虽然在禽流感的防控中起到重要作用,但存在仅能诱导体液免疫、成本高等缺点。因此,研究者们正着力研制新型的基因上程疫苗。以鸡痘病毒为载体表达外源抗原蛋白的重组疫苗研究已十分成熟。目前对重组鸡痘病毒疫苗的免疫原性研究较多,对其生物安全评价较少,同时,重组活载体疫苗的生物安全评价是疫苗能否应用到临床上关键因素。本实验室构建的共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-6基因重组鸡痘病毒(Recombinant fowlpox virus,rFPV-HAIL6)在鸭体内的免疫原性已经得到验证,因此,有必要开展重组鸡痘病毒在水禽体内的生物安全评价。 1重组鸡痘病毒的理化特性与生物学特性研究 rFPV与母本野生鸡痘病毒(Fowlpox virus, FPV)疫苗株分别在不同温度、pH、氯仿、胰酶等作用条件下研究rFPV的理化特性；rFPV与FPV等量感染单层CEF,连续传代,计算各代次比例,来评价重组鸡痘病毒与母本病毒的竞争性。试验结果表明,rFPV与FPV均对胰酶和氯仿敏感,在pH3-9的范围内具有一定的耐受性,对高温敏感。与野生株共传代,其复制竞争能力弱,因此,rFPV比野生鸡痘病毒疫苗株具有更高的生物安全性。 2重组鸡痘病毒免疫麻鸭的生物安全性评价 10日龄商品麻鸭随机分成6组,每组40只,颈部皮下分别免疫rFPV-HAIL6105PFU/只(0.2mL),rFPV-HAIL6106PFU/只，rFPV-HA105PFU/只,FPV105PFU/只,高致病性H5N1亚型禽流感油乳剂灭活苗0.2mL/只,PBS0.2mL作为阴性对照,其中rFPV与FPV免疫组各有5只同居感染的麻鸭。在免疫后第1、7、14d采集麻鸭试验各组麻鸭外周血测定其血液理化指标变化情况,在免疫的1、3、7d同时随机扑杀3只做病毒体内分布试验及组织病理学观察；在免疫后21d每隔1w称量实验各组的麻鸭体重分析rFPV对麻鸭增重影响；在免疫后21d测定同居感染试验麻鸭体内针对FPV的ELISA抗体水平,评价rFPV的同居感染能力；在免疫后的1、3、7、14d采集实验各组的饲料、粪便、饮水、喉头及泄殖腔棉拭子分离病毒,评价rFPV的水平传播能力；在免疫后60d采集rFPV-HAIL6试验组免疫部位肌肉通过southern blot的方法评价重组痘病毒外源基因整合麻鸭染色体DNA的可能性；在动物试验期间每隔1w采集试验各组麻鸭外周血通过HI或者ELISA的方法测定HA抗体和FPV抗体水平,评价rFPV所诱导的抗体水平消长；rFPV以105PFU接种10日龄麻鸭,在接种后4d采集接种部位肌肉,研磨,取研磨液接种10日龄麻鸭,如此盲传5代次,取每代次的接种部位研磨液接种CEF分离病毒。 试验结果显示,重组鸡痘病毒对麻鸭的血液理化个别指标有影响,2w后恢复至正常水平；组织病理学观察未发现明显病变；对麻鸭增重无影响；体内分布试验显示在麻鸭体内除接种部位外其他组织脏器分离不到病毒,PCR可以检测各个组织病毒核酸,免疫组化结果可以检测到rFPV在各组脏器表达的外源蛋白；同居接触不会水平传播；未从饲料、粪便、饮水及棉拭子中分离到病毒不会污染周围环境,对周围环境安全；Southern blot试验表明,外源基因不会整合到麻鸭染色体DNA中；鸭体内盲传,只能从第一代次麻鸭体内分离到病毒,表明病毒不能连续在鸭体内传播,不会发生毒力返强。 3重组鸡痘病毒免疫鹅的安全性评价 重组鸡痘病毒以106PFU免疫10日龄小鹅,同时设置PBS组作为阴性对照。在免疫后不同时间,通过血液的理化指标和组织病理学观察,来评价重组鸡痘病毒对鹅的安全性。 试验结果表明,试验组鹅的各项理化指标在免疫2w后恢复正常,各组织脏器微观病理学观察,未发现明显病理变化。综上所述,重组鸡痘病毒对小鹅也显示出良好的安全性。

【关键词】：
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S852.65
【目录】：

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