茶树谷氨酰胺合成酶（CsGS1-3）基因工程菌的构建

发布时间：2021-12-17 03:59

　　谷氨酰胺（Glutamine,Gln）,学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸,是植物体内氮运输的主要形式,参与植物体内氨的再同化等代谢作用,在植物的生长发育过程中起重要的作用。谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase,GS）是植物中（GS/GOGAT）氨同化的主要途径,其中GS催化NH4+同化成谷氨酰胺。由于GS是氮代谢的关键酶,并且有研究表明利用GS可以催化谷氨酰胺和乙胺发生转谷氨酰基反应从而得到茶氨酸,因此本研究以此为启发点,研究鉴定了茶树GS基因的功能并进行了 GS工程菌的构建。本文从茶树根部cDNA中成功克隆CsGS1-3（登录号:AB117934.1）,并将其与穿梭表达载体pZ8-1连接,通过电转化转入谷氨酸棒状杆菌中对CsGS酶活力进行验证,随后将其与表达载体pET-32a（+）、pGEX-4T-1连接并转入大肠杆菌中进行酶活力验证并进行酶学性质研究。主要研究结果如下:（1）从茶树根部cDNA中成功克隆CsGS1-3,该基因ORF长度为1071bp,由357个氨基酸组成,分子量为39.21 kD,理论等电点为5.47,利用全序列氨基酸序列构建的系统发育树分析表明,... 

【文章来源】： 江丽娜 安徽农业大学

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２－１技术路线??Ｆｉｇ．２－１?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏｕｔｅ??

提取的总ＲＮＡ经１．２?％琼脂糖凝胶电泳检测，含有两条清晰的??２８ＳｒＲＮＡ和１８ＳｒＲＮＡ，条带没有拖尾情况，同时用核酸测量仪检测ＲＮＡ的浓度，以??及ＯＤ２６〇／ＯＤ２８〇和ＯＤ２６〇／〇Ｄ２３〇的比值情况。结果显示总ＲＮＡＯＤ２６ｇ／ＯＤ２８ｇ比值在１．８－??２．２，ＯＤ２６〇／ＯＤ２３〇比值在１．８－２．２之间，说明提取的ＲＮＡ的质量良好，可以用于后续??实验。??４．１．２?ＣｓＧＳ／ｄ的克隆及序列分析??以茶树根部ｃＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增得到１０７１ｂｐ的片段（图４－丨），此序列??与ＮＣＢＩ上ＣｓＧＳ／－Ｊ（ＡＢ１１７９３４．１）的序列一致。通过生物信息学分析，ＣｓＧＳ／－３的??开放阅读框（ＯＲＦ）为１０７１ｂｐ，共编码３５７个氨基酸，蛋白分子量为３９．２１ｋＤ，理论??等电点为５．４７。通过ＣｓＧＳｌ－３氨基酸序列与其他植物中的谷氨酰胺合成酶氨基酸序??列进化树构建发现ＣｓＧＳｌ－３氨基酸序列与猕猴桃（ＰＳＲ９６５９丨．１）的亲缘关系最近（图４－??２）。运用ＭｅｇＡｌｉｇｎ软件将测序结果与ＮＣＢＩ上ＣＸ？幻－Ｊ原氨基酸序列进行比对，发??现结果一致无错配。??Ｍ?１?２?３?４??ｂｐ??１０（Ｈ）?ｈｐ?）??ｂｐ??５００?ｈｐ??ｂｐ??１００?ｂｐ??图４－１?ＯＲＦ扩增产物凝胶电泳图??Ｍ．２ＫｂＤＮＡ分子量标准；１￣４．目的基因Ｃ＾Ｓ／－３??Ｆｉｇ，?４－１?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ＣｓＧＳｌ－３??Ｍ．?２?Ｋｂ?ｍａｋｅｒ?ｏｆ?ＤＮＡ；?１?－４．?ｐ

粒提取，通过电转进入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中，挑取阳性单菌落（如图４－６）??测序验证，成功构建谷氨酸棒状杆菌重组菌株??１３０２２／ｐＺ８－ＱＧ５７－３〇??＼１?１?２?３??２０００?ｂｐ??ｌＯＯＯｂｐ??７５０?ｂｐ??５００?ｈｐ??２§０ｂｐ??ｌＯＯｈｐ??图４－３?ＣｊＧ＊Ｓ厂３?ＯＲＦ扩增产物凝胶电泳图??Ｍ．２ＫｂＤＮＡ分子量标准；１－３．扩增产物０仍／－３??Ｆｉｇ．?４－３?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ＯＲＦ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＣｓＧＳｌ－３??Ｍ．?２?Ｋｂ?ＤＮＡ?ｍａｋｅｒ；?１－３．?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＣｓＧＳｌ－３??２５??


本文编号：3539365