自我调控型CRISPR-Cas9基因编辑系统构建及其减少脱靶效应的研究
发布时间：2021-12-22 23:42
目的:CRISPR-Cas9编辑系统的开发已经开创了基因编辑的新纪元,在生物学,医学,农业和其他领域都有广泛的应用。但Cas9核酸酶在细胞内的过表达会引起脱靶效应,并可能在体内触发免疫反应。为了控制Cas9蛋白在胞内持续表达,实现“适量就好”的Cas9蛋白表达模式,我们构建了一种“自我调控型CRISPR系统”,实现在不改变靶基因编辑效率前提下,降低脱靶效应。方法:我们选取程序性死亡受体1基因（PD-1）为靶基因,对实验室已有的基因编辑质粒pX458-s3质粒（含有识别PD-1基因gRNA序列）进行改造,选取紧邻Cas9基因CAG启动子两端的两个酶切位点（Age I和Kpn I）,分别在这两个酶切位点插入与靶基因gRNA的一致序列,构建出自我调控型基因编辑系统（SR-CRISPR质粒）。我们将SR-CRISPR质粒转染HEK293T细胞,少量表达的Cas9蛋白与靶向PD-1基因的gRNA形成Cas9-gRNA蛋白复合物,在切割靶位点PD-1基因同时,可以识别Cas9基因启动子两端插入的gRNA识别序列并进行切割,导致启动子被切除,终止Cas9基因的转录,抑制Cas9蛋白过量表达,从而降低...
【文章来源】：广东药科大学广东省
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ZFNs的脱靶示意图
广东药科大学硕士研究生学位论文2特异性识别DNA的复合体相结合，诱导FokⅠ在靶基因处产生DSB，通过HDR或NHEJ修复方式对靶基因进行编辑。TALENs和ZFNs人工核酸酶技术一样，都是由核酸内切酶FokⅠ和DNA结合蛋白进行融合形成的[16]。跟ZFNs相比，TALENs的编辑效率和ZFNs不相上下，但是脱靶率会显著降低[17]，因为TALENs的每个串联重复序列仅识别一个碱基[18]（图1-2）[8]。目前TALENs已成功编辑了酵母、水稻、人类体细胞的内源性基因[19-21]。图1-2TALENs的脱靶示意图Figure1-2Theschematicdiagramofoff-targetTALENs图引自何秀斌,谷峰.基因组编辑脱靶研究进展[J].生物工程学报,2017,33(10):1757-1775.1.2CRISPR-Cas9系统介绍及作用原理2013年，一种不依赖于FokⅠ核酸酶的基因组编辑技术—ClusteredregularlyInterspacedshortpalindromicrepeats/associatednuclease9(CRISPR-Cas9)[1]开启了基因编辑的新篇章。CRISPR-Cas9因其操作简单、方便快捷的特点，一问世就受到大家的青睐，迅速超越上一代的ZFNs和TALENs技术[22]。CRISPR/Cas系统是存在于古细菌和细菌中的一种天然免疫系统，可以用来有效的抵抗噬菌体或外源性质粒的侵害。CRISPR/Cas系统由前导序列、间隔片段串联序列、高度保守的重复片段及CRISPR相关蛋白基因组成。根据基因序列及核心要素的不同，将CRISPR/Cas系统分成：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型这3种类型[23]，CRISPR-Cas9系统属于Ⅱ型，由反式激活crRNA(trans-activatingcrRNA,tracrRNA)、crRNA和Cas9蛋白组成，CRISPR-Cas9系统需crRNA和tracrRNA共同引导，才能对外源DNA进行识别并切割，经过进一步的改造，将tracrRNA和crRNA序列整合成一条单链RNA，即单个向导RNA(SingleguideRNA,gRNA)，就能同时发挥反式激活crRNA和cr
制它进入临床应用的最大障碍之一[26,27]，CRISPR-Cas9系统的特异性主要是取决gRNA的识别序列，由于人类基因组极为复杂，设计的gRNA可与非靶向DNA局部发生匹配，这种局部匹配同样也会使Cas9内切酶活性被激活，从而导致在非靶基因处切割DNA进而产生Indel突变，即脱靶效应（off-targeteffects）（图1-3）[8]。此外，Cas9还可以识别非标准PAM，这也会导致一定程度的脱靶。早在2013年就有研究发现，针对不同基因的gRNA，都会导致不同程度的脱靶效应，这一发现使得人们越来越关注CRISPR-Cas9系统的靶向性和安全性[28]。图1-3CRISPR-Cas9的脱靶示意图Figure1-3Theschematicdiagramofoff-targetCRISPR-Cas9图引自何秀斌,谷峰.基因组编辑脱靶研究进展[J].生物工程学报,2017,33(10):1757-1775.近年来，研究者从影响靶向精确性的各方面入手对CRISPR-Cas9系统进行了改进，以期尽可能降低脱靶率[29]。现已有多种脱靶效应的优化策略，如改变gRNA[30-32]或PAM序列的长度[25]，提高gRNA特异性，改变Cas9蛋白构象，控制Cas9-gRNA用量，运用Cas9酶的“关闭开关”，减少Cas9蛋白在细胞核内的丰度等[26,27]。2019年，Charles团队在gRNA上添加了一条能与自身折叠形成“发卡”结构的尾巴，只在与靶向DNA序列完全匹配时才能开锁，从而精准指导核
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用[J]. 王韶嵘,高兴春,陈芳妮,乔文伟,米亚静. 实用癌症杂志. 2019(07)
[2]CRISPR-Cas9系统的基因编辑工具的应用和改进[J]. 王想想,杨荟. 生命的化学. 2019(03)
[3]CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略[J]. 郭全娟,韩秋菊,张建. 生物化学与生物物理进展. 2018(08)
[4]CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展[J]. 程成,舒鹏程,彭小忠. 基础医学与临床. 2018(04)
[5]CRISPR/Cas9技术及其在药物研发中的应用[J]. 陆娣,李莉,邓贤明. 药学学报. 2018(01)
[6]基因组编辑脱靶研究进展[J]. 何秀斌,谷峰. 生物工程学报. 2017(10)
[7]CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HuT-78细胞PD-1分子对其增殖能力的影响[J]. 陈艳新,袁圆阳,蒋永帅,聂红. 现代免疫学. 2017(03)
[8]CRISPR/Cas9技术存在的问题及其改进措施的研究进展[J]. 袁伟曦,喻云梅,胡春财,赵祖国. 生物技术通报. 2017(04)
[9]CRISPR/Cas9系统的分子机制及其在人类疾病基因治疗中的应用[J]. 璩良,李华善,姜运涵,董春升. 遗传. 2015(10)
[10]CRISPR-Cas9技术在干细胞中的应用[J]. 梁丹,吴宇轩,李劲松. 生命科学. 2015(01)
博士论文
[1]具有转录和翻译时滞的基因调控网络的振荡动力学研究[D]. 张远.上海大学 2018
本文编号：3547336
【文章来源】：广东药科大学广东省
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ZFNs的脱靶示意图
广东药科大学硕士研究生学位论文2特异性识别DNA的复合体相结合，诱导FokⅠ在靶基因处产生DSB，通过HDR或NHEJ修复方式对靶基因进行编辑。TALENs和ZFNs人工核酸酶技术一样，都是由核酸内切酶FokⅠ和DNA结合蛋白进行融合形成的[16]。跟ZFNs相比，TALENs的编辑效率和ZFNs不相上下，但是脱靶率会显著降低[17]，因为TALENs的每个串联重复序列仅识别一个碱基[18]（图1-2）[8]。目前TALENs已成功编辑了酵母、水稻、人类体细胞的内源性基因[19-21]。图1-2TALENs的脱靶示意图Figure1-2Theschematicdiagramofoff-targetTALENs图引自何秀斌,谷峰.基因组编辑脱靶研究进展[J].生物工程学报,2017,33(10):1757-1775.1.2CRISPR-Cas9系统介绍及作用原理2013年，一种不依赖于FokⅠ核酸酶的基因组编辑技术—ClusteredregularlyInterspacedshortpalindromicrepeats/associatednuclease9(CRISPR-Cas9)[1]开启了基因编辑的新篇章。CRISPR-Cas9因其操作简单、方便快捷的特点，一问世就受到大家的青睐，迅速超越上一代的ZFNs和TALENs技术[22]。CRISPR/Cas系统是存在于古细菌和细菌中的一种天然免疫系统，可以用来有效的抵抗噬菌体或外源性质粒的侵害。CRISPR/Cas系统由前导序列、间隔片段串联序列、高度保守的重复片段及CRISPR相关蛋白基因组成。根据基因序列及核心要素的不同，将CRISPR/Cas系统分成：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型这3种类型[23]，CRISPR-Cas9系统属于Ⅱ型，由反式激活crRNA(trans-activatingcrRNA,tracrRNA)、crRNA和Cas9蛋白组成，CRISPR-Cas9系统需crRNA和tracrRNA共同引导，才能对外源DNA进行识别并切割，经过进一步的改造，将tracrRNA和crRNA序列整合成一条单链RNA，即单个向导RNA(SingleguideRNA,gRNA)，就能同时发挥反式激活crRNA和cr
制它进入临床应用的最大障碍之一[26,27]，CRISPR-Cas9系统的特异性主要是取决gRNA的识别序列，由于人类基因组极为复杂，设计的gRNA可与非靶向DNA局部发生匹配，这种局部匹配同样也会使Cas9内切酶活性被激活，从而导致在非靶基因处切割DNA进而产生Indel突变，即脱靶效应（off-targeteffects）（图1-3）[8]。此外，Cas9还可以识别非标准PAM，这也会导致一定程度的脱靶。早在2013年就有研究发现，针对不同基因的gRNA，都会导致不同程度的脱靶效应，这一发现使得人们越来越关注CRISPR-Cas9系统的靶向性和安全性[28]。图1-3CRISPR-Cas9的脱靶示意图Figure1-3Theschematicdiagramofoff-targetCRISPR-Cas9图引自何秀斌,谷峰.基因组编辑脱靶研究进展[J].生物工程学报,2017,33(10):1757-1775.近年来，研究者从影响靶向精确性的各方面入手对CRISPR-Cas9系统进行了改进，以期尽可能降低脱靶率[29]。现已有多种脱靶效应的优化策略，如改变gRNA[30-32]或PAM序列的长度[25]，提高gRNA特异性，改变Cas9蛋白构象，控制Cas9-gRNA用量，运用Cas9酶的“关闭开关”，减少Cas9蛋白在细胞核内的丰度等[26,27]。2019年，Charles团队在gRNA上添加了一条能与自身折叠形成“发卡”结构的尾巴，只在与靶向DNA序列完全匹配时才能开锁，从而精准指导核
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用[J]. 王韶嵘,高兴春,陈芳妮,乔文伟,米亚静. 实用癌症杂志. 2019(07)
[2]CRISPR-Cas9系统的基因编辑工具的应用和改进[J]. 王想想,杨荟. 生命的化学. 2019(03)
[3]CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略[J]. 郭全娟,韩秋菊,张建. 生物化学与生物物理进展. 2018(08)
[4]CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展[J]. 程成,舒鹏程,彭小忠. 基础医学与临床. 2018(04)
[5]CRISPR/Cas9技术及其在药物研发中的应用[J]. 陆娣,李莉,邓贤明. 药学学报. 2018(01)
[6]基因组编辑脱靶研究进展[J]. 何秀斌,谷峰. 生物工程学报. 2017(10)
[7]CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HuT-78细胞PD-1分子对其增殖能力的影响[J]. 陈艳新,袁圆阳,蒋永帅,聂红. 现代免疫学. 2017(03)
[8]CRISPR/Cas9技术存在的问题及其改进措施的研究进展[J]. 袁伟曦,喻云梅,胡春财,赵祖国. 生物技术通报. 2017(04)
[9]CRISPR/Cas9系统的分子机制及其在人类疾病基因治疗中的应用[J]. 璩良,李华善,姜运涵,董春升. 遗传. 2015(10)
[10]CRISPR-Cas9技术在干细胞中的应用[J]. 梁丹,吴宇轩,李劲松. 生命科学. 2015(01)
博士论文
[1]具有转录和翻译时滞的基因调控网络的振荡动力学研究[D]. 张远.上海大学 2018
本文编号：3547336
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3547336.html
最近更新
教材专著
