拟南芥At3g21380基因启动子ABRE元件功能鉴定

发布时间：2021-12-24 09:19

　　种子特异性启动子能够驱动外源基因只在植物种子中大量表达,外源基因组织特异性转录活性的高低通常由启动子上的顺式作用元件来参与调控。研究表明,ABRE元件是与种子特异性表达相关的元件,因此,对该元件进行功能初析,能够为后续更加深入的研究种子特异性启动子的调控机理奠定基础。拟南芥At3g21380基因是一种甘露糖结合蛋白编码基因,实验室之前研究结果证明该基因启动子为种子特异性启动子。此外,对该基因启动子上的顺式作用元件分析结果还表明:在启动子中存在ABRE元件和RY元件、skn-1元件、GCN4元件等与种子特异性表达相关的顺式作用元件。在本项研究中,为了明确ABRE元件对At3g21380启动子种子特异性转录活性的影响,首先通过设计ABRE元件的突变位点及特异性PCR扩增引物,克隆得到突变启动子片段,然后将目的片段连接到植物基因表达载体上。利用农杆菌介导的浸花法将验证正确的表达载体转化野生型拟南芥。收获浸染后的拟南芥种子进行潮霉素抗性筛选实验。将筛选之后得到的转基因纯系拟南芥进行PCR鉴定,最终获得含有正确突变启动子片段的转基因纯系拟南芥。对野生型及突变启动子片段的转基因纯系种子进行GUS染... 

【文章来源】：曲阜师范大学山东省

【文章页数】：41 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

表达载体构建示意图

第三章结果与分析19第三章结果与分析3.1ABRE元件突变启动子的PCR扩增鉴定实验室前期的分析结果表明：在At3g21380启动子上含有两个ABRE元件。参考该分析结果，将这两个ABRE元件分别命名为ABRE1和ABRE2，以野生型启动子At3g21380的重组质粒为模板，根据ABRE1序列和ABRE2序列，分别设计相应突变引物并进行PCR扩增，得到扩增产物后进行电泳分析。电泳结果显示，各突变产物片段电泳条带位置符合预期扩增目的序列的910bp大小(图3.1)。图3.1突变启动子片段PCR产物M：DNA标准分子量；1：ABRE1突变启动子片段；2：ABRE2突变启动子片段Figure3.1PCRproductofthemutantpromoterfragmentsM:DNAMaker;1:theABRE1mutantpromoterfragment;2:theABRE2mutantpromoterfragment3.2ABRE元件突变启动子表达载体的酶切鉴定提取阳性菌落的重组质粒，对其进行双酶切，酶切后电泳检测，电泳结果显示，酶切后均产生一大、一小两条条带。其中，大条带位置与预期线性载体片段长度吻合，小条带位置符合预期扩增目的序列的910bp大小(图3.2)。将经过酶切鉴定正确的阳性菌落送往公司测序。最终测序结果表明突变片段序列与预期序列一致，pMUTABRE1-GUS和pMUTABRE2-GUS均构建成功。

第三章结果与分析20图3.2表达载体的双酶切鉴定M：DNA标准分子量；1：pMUTABRE1-GUS载体双酶切片段；2：pMUTABRE2-GUS载体双酶切片段Figure3.2doubledigestionofexpressionvectorM:DNAMarker;1:pMUTABRE1-GUSvectordoubledigestionfragment;2:pMUTABRE2-GUSvectordoubledigestionfragment3.3ABRE元件突变启动子转基因纯合株系的筛选与获得为获得纯合突变体株系，首先将已经得到的pMUTABRE1-GUS和pMUTABRE2-GUS转化农杆菌GV3101，再经农杆菌浸染野生型拟南芥，之后收获T0代种子。按照上述筛选纯合株系的方法，通过含潮霉素抗性的1/2MS固体培养基，对T0代种子进行抗性筛选实验，获得T1代种子，继续按照同样的筛选方法，又获得T2代种子，最终通过抗性筛选实验，成功获得了含有pMUTABRE1-GUS和pMUTABRE2-GUS表达载体的T3代突变体纯合株系。通过PCR扩增方法对MUTABRE1-GUS和MUTABRE2-GUS转基因纯合株系进行阳性筛选鉴定。以下是部分株系的琼脂糖凝胶电泳结果(图3.3)。电泳结果显示，电泳条带位置符合预期扩增目的序列的540bp大小，说明两个ABRE元件突变启动子均成功转化进入拟南芥，实验最终获得了正确含有ABRE元件突变启动子的转基因纯合株系。图3.3突变启动子转基因纯合株系PCR鉴定M：DNA标准分子量；1-4：pMUTABRE1-GUS转基因纯合株系；5-8：pMUTABRE2-GUS转基


本文编号：3550224