一种基于TRV-VIGS的高通量大豆基因功能验证方法
发布时间：2021-12-31 13:38
病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）是一种快速、高效、便捷的基因功能验证的反向遗传学手段。烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）介导的VIGS技术可以在多种植物上实现基因沉默,但其应用却因由侵染操作引起的植物损伤与沉默效率低下受到限制。本研究以大豆（Glycine max）为材料,通过对农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染方法进行改良,使TRV从植物根部侵染,随病毒在植物体内的运输,实现对植物内源基因的系统性沉默。实验结果表明,将携带VIGS载体的农杆菌使用本方法从根部侵染大豆后,可以使同一处理批次内近全部植株产生有效基因沉默,基因沉默效率均在67%以上,最高达到98%;对处理植株不同位置的叶片进行检测,发现第1至第3轮三出复叶均有较为理想的沉默效果,其中第1轮三出复叶的沉默效率最高;本研究有效沉默的基因包括非特异性脂质转运蛋白（non-specific lipid-transfer protein, LTP）、病程相关蛋白1 （pathogenesis-related pro...
【文章来源】：农业生物技术学报. 2020,28(11)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
待沉默基因mRNA中VIGS的靶向位置
本课题组前期研究表明，TRV不影响大豆与SMV的互作方式(刘晓彬等,2015)。为了筛选大豆与SMV互作过程中影响病毒运输的关键基因，需要以接种SMV的上位叶作为实验材料。因此，检测TRV-VIGS对植株不同位置的叶片是否可以有效沉默目的基因是此类实验开展的前提。q RT-PCR分析结果表明(图3)，在沉默XTH的植株中，第1轮三出复叶沉默效率最高可达89%(L1-#13)，最低为67%(L1-#11)，平均沉默效率为76%；第2轮三出复叶沉默效率最高可达76%(L2-#13)，最低为55%(L2-#11)，平均沉默效率为66%；第3轮三出复叶沉默效率最高可达63%(L3-#12)，最低为42%(L3-#10)，平均沉默效率为50%(图3A)。在沉默CYSTM的植株中，沉默效率在第1轮三出复叶中平均为90%，第2轮三出复叶平均为86%，第3轮三出复叶平均为76%(图3B)。这一结果表明，本方法可以在同一植株的不同叶片间达到较好的基因沉默效果，并且第1轮三出复叶的沉默效率要优于第2和第3轮三出复叶，这为后续进一步研究病毒长距离运输及系统获得抗性(systematic acquired resistance,SAR)等涉及植物性状长期观察的实验提供了良好的实验操作体系。2.4 q RT-PCR检测不同基因的沉默效率
VIGS技术是一项便捷、高效的反向遗传学实验方法，与RNAi相比，利用该方法进行基因功能分析时避免了遗传转化操作费时、费力的缺点。在以往的报道中，VIGS病毒的接种方法往往为茎部注射(刘晓彬等,2015)，叶片注射(Juvale et al.,2012)，或直接在叶片上涂抹体外转录的病毒RNA(Gu et al.,2020)。这些方法通常会造成植物组织的损伤，且操作繁琐，不利于大量制备沉默目的基因的植株材料。本研究对TRV-VIGS的侵染方法进行了改良，使其可以在短时间获得大量的基因沉默植物材料，并从个体均一性、组织分布有效性和基因适用性共3个层面对改良后VIGS实验操作方法的效果进行了检验。本研究采用"浇灌法"接种VIGS病毒，其实质是利用根癌农杆菌侵染植物根系的天然特性。在携带有p TRV1和p TRV2的农杆菌混合物侵染植物根系后，TRV病毒在侵染的细胞内完成组装，并进入韧皮部进行长距离运输，实现系统侵染。然而不可否认的是，在培养介质中浇灌农杆菌很难使每株植物都受到相同水平的侵染，因此植株体内TRV病毒的水平，以及基因的沉默效率很难保持一致。为了克服这些缺陷，本研究在侵染缓冲液中加入了L-Cys和表面活性剂Silwet L-77，以提高农杆菌溶液的扩散均匀程度以及农杆菌的侵染效率。此外，在结果图2和图3中XTH和CYSTM的沉默效率有一定差别，这可能是由不同批次间农杆菌活性的区别导致的。本研究还发现，TRV可以诱导植株发生系统性基因沉默，其中XTH基因的平均沉默效率在第1轮三出复叶为76%，第2轮三出复叶为66%，第3轮三出复叶为50%(图3A);CYSTM基因的平均沉默效率在第1轮三出复叶为90%，第2轮三出复叶为86%，第3轮三出复叶为76%(图3B)。本研究观察到，TRV-VIGS的沉默效率在不同位置的叶片中是不同的，这可能是由于TRV病毒在植物体内的不均匀分布导致的。本研究还检测了TRV-VIGS对LTP、PR1、TLP和DHN基因的沉默效率。绿豆(Vigna radiata) LTP具有抑制如茄病镰刀菌(Fusarium solani)等真菌和金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等细菌的活性(Wang et al.,2004);PR1参与水杨酸调控的免疫反应(Tomoya et al.,1998)，胡椒(Piper nigrum) PR1基因在转录水平响应TMV侵染(Sujon et al.,2005);TLP在啤酒花(Humulus lupulus)受白粉菌(Podospheara macularis)侵染后诱导表达(Kappagantu et al.,2017)，其翻译产物参与多种非生物胁迫的响应过程(刘潮等,2018)；大麦(Hordeum vulgare) DHN在寒冷和干旱处理后表达升高(Zhu et al.,2000);XTHs主要分布于细胞壁(Montserrat et al.,2006)，苹果(Malus domestica) XTH响应扩展青霉(Penicillium expansum)的侵染(Mu?oz-Bertomeu,Lorences,2014);CYSTMs广泛存在于真核细胞中(Venancio Aravid,2010)，拟南芥CYSTM响应包括盐胁迫在内的一系列环境刺激(Xu et al.,2018)。上述这些基因在大豆内的同源物均响应SMV的侵染，可能参与大豆对SMV的防卫反应，因此成为本研究检测的目标基因。根据本实验室前期研究结果，EF1b基因在病毒侵染前后的表达水平具有良好的稳定性(Ma et al.,2013)，因此选择EF1b作为内参基因检测目的基因的相对表达量。本研究在TRV-VIGS沉默的基因适用性检测中，发现不同的基因可达到的沉默效率有所不同。其中XTH基因的平均沉默效率最高(93%)(图2),TLP基因的平均沉默效率最低(44%)(图4)，说明不同基因的沉默效率存在差异。基因的沉默效率受多重因素的影响，除了上面提及的农杆菌活性和TRV在体内的分布影响外，基因沉默区段的选择也是主要的影响因素之一。Ding等(2018)的研究表明，在BMV-VIGS载体中插入的目的基因片段越长，基因的沉默效率越高。高阳等(2011)的研究发现，在TNV-VIGS载体中以反向重复的形式插入基因的特异性片段，可以获得比单方向插入更好的沉默效果。Ge等(2016)使用Sfold工具对不同特异性区段的VIGS效率进行评估和预测，发现靶向m RNA的不同位置所产生的沉默效率有较大区别。因此在本研究中不同基因沉默效率的差异也可能与沉默区段的设计有关。虽然这种推断仍需要更多的实验证据来证实，但是考虑到选择不同的区段构建VIGS载体可能是获得相对高效沉默植株的最廉价方法，因此建议在考虑基因沉默特异性的前提下选择同一基因的不同区段，以增加后续工作的说服力。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于核糖体跳跃的多顺反子共表达技术在拟南芥上的应用[J]. 吴立柱,安叶芝,张洁,孙天杰,王冬梅. 农业生物技术学报. 2019(07)
[2]植物类甜蛋白基因家族研究进展[J]. 刘潮,韩利红,王海波,高永,唐利洲. 生物技术通报. 2018(03)
[3]基于miRNA-30的RNAi表达框架的构建及其有效性验证[J]. 李亚红,赵丹丹,李思佳,覃淇,邱彤彤,彭剑雄. 临床检验杂志. 2016(08)
[4]Prediction of VIGS efficiency by the Sfold program and its reliability analysis in Gossypium hirsutum[J]. Xiaoyang Ge,Jie Wu,Chaojun Zhang,Qianhua Wang,Yuxia Hou,Zuoren Yang,Zhaoen Yang,Zhenzhen Xu,Ye Wang,Lili Lu,Xueyan Zhang,Jinping Hua,Fuguang Li. Science Bulletin. 2016(07)
[5]TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立[J]. 刘晓彬,刘娜,李福宽,吴立柱,张洁,王冬梅. 中国农业科学. 2015(12)
[6]烟草坏死病毒A诱导的基因沉默及其条件优化[J]. 高阳,张永亮,张晓峰,韩成贵,于嘉林,李大伟. 生物化学与生物物理进展. 2011(10)
[7]番茄红素β环化酶基因（Lyc-β）RNAi载体构建及表达鉴定[J]. 马超,马兵钢,郝青南,何娟,鲁晓燕,吴志苹. 农业生物技术学报. 2010(01)
[8]VIGS:植物功能基因组学研究的革命[J]. 姚丹青,张微微,原丽华,潘俊松,何欢乐,蔡润. 分子植物育种. 2009(01)
[9]VIGS技术在植物基因功能研究中的应用[J]. 杨迎伍,李正国,宋红丽,杨平. 植物生理学通讯. 2007(02)
[10]PTGS/RNAi的作用机制及其应用[J]. 梁燕,杨永政,陈大明,王鸣,陈杭. 中国农学通报. 2005(12)
本文编号：3560356
【文章来源】：农业生物技术学报. 2020,28(11)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
待沉默基因mRNA中VIGS的靶向位置
本课题组前期研究表明，TRV不影响大豆与SMV的互作方式(刘晓彬等,2015)。为了筛选大豆与SMV互作过程中影响病毒运输的关键基因，需要以接种SMV的上位叶作为实验材料。因此，检测TRV-VIGS对植株不同位置的叶片是否可以有效沉默目的基因是此类实验开展的前提。q RT-PCR分析结果表明(图3)，在沉默XTH的植株中，第1轮三出复叶沉默效率最高可达89%(L1-#13)，最低为67%(L1-#11)，平均沉默效率为76%；第2轮三出复叶沉默效率最高可达76%(L2-#13)，最低为55%(L2-#11)，平均沉默效率为66%；第3轮三出复叶沉默效率最高可达63%(L3-#12)，最低为42%(L3-#10)，平均沉默效率为50%(图3A)。在沉默CYSTM的植株中，沉默效率在第1轮三出复叶中平均为90%，第2轮三出复叶平均为86%，第3轮三出复叶平均为76%(图3B)。这一结果表明，本方法可以在同一植株的不同叶片间达到较好的基因沉默效果，并且第1轮三出复叶的沉默效率要优于第2和第3轮三出复叶，这为后续进一步研究病毒长距离运输及系统获得抗性(systematic acquired resistance,SAR)等涉及植物性状长期观察的实验提供了良好的实验操作体系。2.4 q RT-PCR检测不同基因的沉默效率
VIGS技术是一项便捷、高效的反向遗传学实验方法，与RNAi相比，利用该方法进行基因功能分析时避免了遗传转化操作费时、费力的缺点。在以往的报道中，VIGS病毒的接种方法往往为茎部注射(刘晓彬等,2015)，叶片注射(Juvale et al.,2012)，或直接在叶片上涂抹体外转录的病毒RNA(Gu et al.,2020)。这些方法通常会造成植物组织的损伤，且操作繁琐，不利于大量制备沉默目的基因的植株材料。本研究对TRV-VIGS的侵染方法进行了改良，使其可以在短时间获得大量的基因沉默植物材料，并从个体均一性、组织分布有效性和基因适用性共3个层面对改良后VIGS实验操作方法的效果进行了检验。本研究采用"浇灌法"接种VIGS病毒，其实质是利用根癌农杆菌侵染植物根系的天然特性。在携带有p TRV1和p TRV2的农杆菌混合物侵染植物根系后，TRV病毒在侵染的细胞内完成组装，并进入韧皮部进行长距离运输，实现系统侵染。然而不可否认的是，在培养介质中浇灌农杆菌很难使每株植物都受到相同水平的侵染，因此植株体内TRV病毒的水平，以及基因的沉默效率很难保持一致。为了克服这些缺陷，本研究在侵染缓冲液中加入了L-Cys和表面活性剂Silwet L-77，以提高农杆菌溶液的扩散均匀程度以及农杆菌的侵染效率。此外，在结果图2和图3中XTH和CYSTM的沉默效率有一定差别，这可能是由不同批次间农杆菌活性的区别导致的。本研究还发现，TRV可以诱导植株发生系统性基因沉默，其中XTH基因的平均沉默效率在第1轮三出复叶为76%，第2轮三出复叶为66%，第3轮三出复叶为50%(图3A);CYSTM基因的平均沉默效率在第1轮三出复叶为90%，第2轮三出复叶为86%，第3轮三出复叶为76%(图3B)。本研究观察到，TRV-VIGS的沉默效率在不同位置的叶片中是不同的，这可能是由于TRV病毒在植物体内的不均匀分布导致的。本研究还检测了TRV-VIGS对LTP、PR1、TLP和DHN基因的沉默效率。绿豆(Vigna radiata) LTP具有抑制如茄病镰刀菌(Fusarium solani)等真菌和金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等细菌的活性(Wang et al.,2004);PR1参与水杨酸调控的免疫反应(Tomoya et al.,1998)，胡椒(Piper nigrum) PR1基因在转录水平响应TMV侵染(Sujon et al.,2005);TLP在啤酒花(Humulus lupulus)受白粉菌(Podospheara macularis)侵染后诱导表达(Kappagantu et al.,2017)，其翻译产物参与多种非生物胁迫的响应过程(刘潮等,2018)；大麦(Hordeum vulgare) DHN在寒冷和干旱处理后表达升高(Zhu et al.,2000);XTHs主要分布于细胞壁(Montserrat et al.,2006)，苹果(Malus domestica) XTH响应扩展青霉(Penicillium expansum)的侵染(Mu?oz-Bertomeu,Lorences,2014);CYSTMs广泛存在于真核细胞中(Venancio Aravid,2010)，拟南芥CYSTM响应包括盐胁迫在内的一系列环境刺激(Xu et al.,2018)。上述这些基因在大豆内的同源物均响应SMV的侵染，可能参与大豆对SMV的防卫反应，因此成为本研究检测的目标基因。根据本实验室前期研究结果，EF1b基因在病毒侵染前后的表达水平具有良好的稳定性(Ma et al.,2013)，因此选择EF1b作为内参基因检测目的基因的相对表达量。本研究在TRV-VIGS沉默的基因适用性检测中，发现不同的基因可达到的沉默效率有所不同。其中XTH基因的平均沉默效率最高(93%)(图2),TLP基因的平均沉默效率最低(44%)(图4)，说明不同基因的沉默效率存在差异。基因的沉默效率受多重因素的影响，除了上面提及的农杆菌活性和TRV在体内的分布影响外，基因沉默区段的选择也是主要的影响因素之一。Ding等(2018)的研究表明，在BMV-VIGS载体中插入的目的基因片段越长，基因的沉默效率越高。高阳等(2011)的研究发现，在TNV-VIGS载体中以反向重复的形式插入基因的特异性片段，可以获得比单方向插入更好的沉默效果。Ge等(2016)使用Sfold工具对不同特异性区段的VIGS效率进行评估和预测，发现靶向m RNA的不同位置所产生的沉默效率有较大区别。因此在本研究中不同基因沉默效率的差异也可能与沉默区段的设计有关。虽然这种推断仍需要更多的实验证据来证实，但是考虑到选择不同的区段构建VIGS载体可能是获得相对高效沉默植株的最廉价方法，因此建议在考虑基因沉默特异性的前提下选择同一基因的不同区段，以增加后续工作的说服力。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于核糖体跳跃的多顺反子共表达技术在拟南芥上的应用[J]. 吴立柱,安叶芝,张洁,孙天杰,王冬梅. 农业生物技术学报. 2019(07)
[2]植物类甜蛋白基因家族研究进展[J]. 刘潮,韩利红,王海波,高永,唐利洲. 生物技术通报. 2018(03)
[3]基于miRNA-30的RNAi表达框架的构建及其有效性验证[J]. 李亚红,赵丹丹,李思佳,覃淇,邱彤彤,彭剑雄. 临床检验杂志. 2016(08)
[4]Prediction of VIGS efficiency by the Sfold program and its reliability analysis in Gossypium hirsutum[J]. Xiaoyang Ge,Jie Wu,Chaojun Zhang,Qianhua Wang,Yuxia Hou,Zuoren Yang,Zhaoen Yang,Zhenzhen Xu,Ye Wang,Lili Lu,Xueyan Zhang,Jinping Hua,Fuguang Li. Science Bulletin. 2016(07)
[5]TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立[J]. 刘晓彬,刘娜,李福宽,吴立柱,张洁,王冬梅. 中国农业科学. 2015(12)
[6]烟草坏死病毒A诱导的基因沉默及其条件优化[J]. 高阳,张永亮,张晓峰,韩成贵,于嘉林,李大伟. 生物化学与生物物理进展. 2011(10)
[7]番茄红素β环化酶基因（Lyc-β）RNAi载体构建及表达鉴定[J]. 马超,马兵钢,郝青南,何娟,鲁晓燕,吴志苹. 农业生物技术学报. 2010(01)
[8]VIGS:植物功能基因组学研究的革命[J]. 姚丹青,张微微,原丽华,潘俊松,何欢乐,蔡润. 分子植物育种. 2009(01)
[9]VIGS技术在植物基因功能研究中的应用[J]. 杨迎伍,李正国,宋红丽,杨平. 植物生理学通讯. 2007(02)
[10]PTGS/RNAi的作用机制及其应用[J]. 梁燕,杨永政,陈大明,王鸣,陈杭. 中国农学通报. 2005(12)
本文编号：3560356
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3560356.html
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