牛LINC24065基因和GPR1-ZDBF2区域的基因组印记及调控机理研究
发布时间：2022-01-19 19:20
基因组印记（genomic imprinting）是指由于亲本染色体差异表观遗传修饰（epigenetic modification）所导致的单等位基因表达。这些亲本来源特异性的单等位表达基因称为印记基因（imprinting gene）。在哺乳动物中,印记基因在胎儿生长发育、胎盘功能和出生后行为的调控中都起着重要的作用。近年来,随着对印记基因的广泛研究和深入理解,发现它对动物重要的经济性状和繁育至关重要。印记基因的表达紊乱是体细胞核移植动物（somatic cell nuclear transfer,SCNT）出生死亡和发育异常的重要因素。然而,大多数印记基因的发现和研究都集中在人类和小鼠种,而在家畜上的研究还很少。本研究以牛DLK1-DIO3印记区域的LINC24065基因和GPR1-ZDBF2区域为研究对象,分析其在新生和成年阶段牛组织及胎盘中的印记和甲基化状态,同时也对新生死亡体细胞核移植牛组织进行了检测,得到以下研究结果:1.利用RACE及RT-PCR技术,在牛DLK1-DIO3的印记域基因MEG8和MEG9之间,得到了一个具有6个可变剪接体（V1-V6）的长基因间非编码RN...
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
表观遗传调控水平[5]
7复合物影响附近基因的表达。即lncRNA的表达常常与附近基因的表达相关[8,66]。1.3.2长非编码RNA的调控模式根据lncRNA调控基因表达的模式，lncRNA可分为四种主要类型（图1-2）[67]，即信号（signal）、诱饵（decoys）、向导（guides）和脚手架（scaffolds），这些模式之间并不相互排斥，它们可以共同作用[68]。具有与信号或诱饵相关功能的lncRNA分别参与基因的激活或抑制。作为引导者的lncRNA会招募染色质修饰酶来调节基因，通过顺式或反式的方式来调控靶基因的表达。作为支架的lncRNAs可以招募多个蛋白质来组装核糖核酸复合物，这些复合物通常作用于染色质和/或调节组蛋白标记。许多lncRNAs具备一个以上的特征，因此具有综合功能，如下图1-2。图1-2LncRNAs在表观遗传学中的调控[67]A:IncRNA可能以蛋白质复合物为支架，以染色质重塑组分为诱饵，以直接重构者为导向。B:LncRNA引导表观遗传修饰改变染色质结构、组蛋白甲基化或乙酰化水平以及DNA甲基化水平。Figure1-2TheregulationoflncRNAsinepigenetics（A）LncRNAmayrecruitproteincomplexesasscaffold,deceivechromatin-remodelingcomponentsasdecoy,anddirectremodelersasguide.（B）LncRNAguidesepigeneticmodifierstochangethechromatinstructure,histonemethylationoracetylationlevel,andDNAmethylationlevel.1.3.3长非编码RNA的鉴定方法目前，lncRNAs鉴定和功能注释主要采取多种实验方法的结合：（1）使用RNA-seq和ChIP-seq发现新的非编码转录本；（2）利用生物信息分析对转录区范围，转录产物量进行注释；（3）在不同类型细胞，组织类型和条件下对lncRNAs进行定量；（4）共表达或协同调控研究，在细胞株系或异种移植物中，通过功能缺失和获得实
20Water混匀。（2）65℃孵育5min，冰浴2min（3）将1μLgDNARemover，10μL2×ESReactionMix，1μLRTEnzymeMix混合物，加入（2）的反应液中。（4）42℃反应30min，85℃5s将酶（EasyScriptRT/RI与gDNARmover）灭活。（5）-20℃贮存备用。2.2.5LINC24065cDNA的克隆2.2.5.1EST序列的获得利用UCSC数据库，在牛21号染色体的DLK1-DIO3印记域内，基因MEG8和MEG9间发现了两个可剪接的ESTs簇（ESTs1，ESTs2）。ESTs1包括4个EST序列：DY096394，DY196469，CB463975和CR852162。ESTs2包括6个EST序列：DN517831，CB431395，CB849952，AU097863和EE355346。每簇ESTs的各序列相互之间有交叠（图2-1）。ESTs1和ESTs2之间没有交叠，且在位置上相邻。今年来在鼠中，meg8和meg9之间已经鉴定了几个lncRNAs，因此推测它们可能是同一基因的部分序列；并且通过这些EST序列间的交叠关系，可以认为该基因应该还有可变剪接体存在。图2-1基因MEG8-MEG9间的ESTsFigure2-1ESTssitebetweenMEG8andMEG92.2.5.2RACE引物的设计选取ESTs1中的交叠序列区，利用Oligo7软件设计RACE引物，其中3"端引物为嵌套引物。5"RACE引物（RACE5"）和3"RACE引物（RACE3"）位于序列DY196469的第2个外显子，3"端嵌套引物RACE3"-1位于DY196469的第7个外显子上。2.2.5.3LINC24065序列的获得（1）5"/3"RACEFirst-StrandcDNA的合成以成年牛大脑组织做为RACE模板，依照SMARTerRACE5"/3"Kit的方法步骤
【参考文献】：
期刊论文
[1]核移植介导的哺乳动物体细胞核重编程研究进展[J]. 吴霄,庄站伟,马晓莉,黄思秀,李紫聪,徐铮. 生物技术通报. 2019(11)
[2]中国细胞重编程和多能干细胞研究进展[J]. 康岚,陈嘉瑜,高绍荣. 遗传. 2018(10)
[3]体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复[J]. 纪慧丽,卢晟盛,潘登科. 遗传. 2014(12)
[4]哺乳动物印记域DLK1-DIO3的研究进展[J]. 赵丽霞,赵高平,周欢敏. 遗传. 2010(08)
本文编号：3597417
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
表观遗传调控水平[5]
7复合物影响附近基因的表达。即lncRNA的表达常常与附近基因的表达相关[8,66]。1.3.2长非编码RNA的调控模式根据lncRNA调控基因表达的模式，lncRNA可分为四种主要类型（图1-2）[67]，即信号（signal）、诱饵（decoys）、向导（guides）和脚手架（scaffolds），这些模式之间并不相互排斥，它们可以共同作用[68]。具有与信号或诱饵相关功能的lncRNA分别参与基因的激活或抑制。作为引导者的lncRNA会招募染色质修饰酶来调节基因，通过顺式或反式的方式来调控靶基因的表达。作为支架的lncRNAs可以招募多个蛋白质来组装核糖核酸复合物，这些复合物通常作用于染色质和/或调节组蛋白标记。许多lncRNAs具备一个以上的特征，因此具有综合功能，如下图1-2。图1-2LncRNAs在表观遗传学中的调控[67]A:IncRNA可能以蛋白质复合物为支架，以染色质重塑组分为诱饵，以直接重构者为导向。B:LncRNA引导表观遗传修饰改变染色质结构、组蛋白甲基化或乙酰化水平以及DNA甲基化水平。Figure1-2TheregulationoflncRNAsinepigenetics（A）LncRNAmayrecruitproteincomplexesasscaffold,deceivechromatin-remodelingcomponentsasdecoy,anddirectremodelersasguide.（B）LncRNAguidesepigeneticmodifierstochangethechromatinstructure,histonemethylationoracetylationlevel,andDNAmethylationlevel.1.3.3长非编码RNA的鉴定方法目前，lncRNAs鉴定和功能注释主要采取多种实验方法的结合：（1）使用RNA-seq和ChIP-seq发现新的非编码转录本；（2）利用生物信息分析对转录区范围，转录产物量进行注释；（3）在不同类型细胞，组织类型和条件下对lncRNAs进行定量；（4）共表达或协同调控研究，在细胞株系或异种移植物中，通过功能缺失和获得实
20Water混匀。（2）65℃孵育5min，冰浴2min（3）将1μLgDNARemover，10μL2×ESReactionMix，1μLRTEnzymeMix混合物，加入（2）的反应液中。（4）42℃反应30min，85℃5s将酶（EasyScriptRT/RI与gDNARmover）灭活。（5）-20℃贮存备用。2.2.5LINC24065cDNA的克隆2.2.5.1EST序列的获得利用UCSC数据库，在牛21号染色体的DLK1-DIO3印记域内，基因MEG8和MEG9间发现了两个可剪接的ESTs簇（ESTs1，ESTs2）。ESTs1包括4个EST序列：DY096394，DY196469，CB463975和CR852162。ESTs2包括6个EST序列：DN517831，CB431395，CB849952，AU097863和EE355346。每簇ESTs的各序列相互之间有交叠（图2-1）。ESTs1和ESTs2之间没有交叠，且在位置上相邻。今年来在鼠中，meg8和meg9之间已经鉴定了几个lncRNAs，因此推测它们可能是同一基因的部分序列；并且通过这些EST序列间的交叠关系，可以认为该基因应该还有可变剪接体存在。图2-1基因MEG8-MEG9间的ESTsFigure2-1ESTssitebetweenMEG8andMEG92.2.5.2RACE引物的设计选取ESTs1中的交叠序列区，利用Oligo7软件设计RACE引物，其中3"端引物为嵌套引物。5"RACE引物（RACE5"）和3"RACE引物（RACE3"）位于序列DY196469的第2个外显子，3"端嵌套引物RACE3"-1位于DY196469的第7个外显子上。2.2.5.3LINC24065序列的获得（1）5"/3"RACEFirst-StrandcDNA的合成以成年牛大脑组织做为RACE模板，依照SMARTerRACE5"/3"Kit的方法步骤
【参考文献】：
期刊论文
[1]核移植介导的哺乳动物体细胞核重编程研究进展[J]. 吴霄,庄站伟,马晓莉,黄思秀,李紫聪,徐铮. 生物技术通报. 2019(11)
[2]中国细胞重编程和多能干细胞研究进展[J]. 康岚,陈嘉瑜,高绍荣. 遗传. 2018(10)
[3]体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复[J]. 纪慧丽,卢晟盛,潘登科. 遗传. 2014(12)
[4]哺乳动物印记域DLK1-DIO3的研究进展[J]. 赵丽霞,赵高平,周欢敏. 遗传. 2010(08)
本文编号：3597417
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3597417.html
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