斑马鱼天然免疫相关基因TAK1和TANK的克隆及其功能研究

发布时间：2022-01-25 04:08

　　斑马鱼（Danio rerio）作为一种重要的模式生物,已被广泛应用于生物学各个领域,如在生物医学研究方面,斑马鱼作为研究脊椎动物的发育和造血的模型已被广泛采用。近年来,斑马鱼也被逐步应用于免疫相关的实验。转化生长因子β-激活激酶1（Transforming growth factorβ-activated kinase 1,TAK1）是MAP3K家族的成员,脊椎动物的TAK1在人和哺乳动物中能够调控由IL-1介导的NF-κB,JNK和p38的激活;TRAF家族相关的NF-κB激活因子（the TRAF family member-associated NF-κB activator,TANK）能够参与调控核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路。但是在斑马鱼中少有关于TAK1和TANK在天然免疫中功能的报道。为探究TAK1和TANK在斑马鱼天然免疫中的作用,本研究团队率先在斑马鱼中展开对TAK1和TANK的功能研究,克隆并获得了一种斑马鱼TAK1剪接异构体（Danio rerio TAK1,Dr TAK1）和斑马鱼TANK基因（Danio rerio TA... 

【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校

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DrTAK1和DrTANK的结构预测

硕士学位论文30图3-2：几种脊椎动物的TAK1，TANK的氨基酸序列比对。（A）利用进化分析软件（本次使用的软件包括有：MEGA6和GeneDoc）对人、小鼠、原鸡和斑马鱼TAK1的氨基酸序列进行进化分析。（B）利用进化分析软件对人、小鼠、原鸡和斑马鱼TANK的氨基酸序列进行进化分析。Fig3-2:AminoacidsequencesalignmentofTAK1andTANKofseveralvertebrates.(A)Usingevolutionanalysissoftware(thesoftwareusedincludes:MEGA6andGeneDoc)toperformevolutionaryanalysisontheTAK1aminoacidsequencesofhuman,mouse,rawchickenandzebrafish.(B)UsingevolutionanalysissoftwaretoperformevolutionaryanalysisontheTANKaminoacidsequencesofhuman,mouse,rawchickenandzebrafish.BA

硕士学位论文32转染进HEK293T和EPC细胞中来探究DrTAK1和DrTANK在体外的表达情况，细胞转染了36-48h后，收集全细胞裂解液，用于制作Western-Blot实验的样品，根据构建的表达载体的情况，转染进细胞中的几种质粒表达的情况使用鼠源抗体（Flag）检测。在两种细胞内DrTAK1蛋白实际表达72kDa要比预测的65kDa稍微大一些，说明DrTAK1能够在两种细胞中表达（图A、B）；同样DrTANK在两种细胞中均能表达，且蛋白大小为50kDa，要比预测的39.27kDa大一些（图C、D）。图3-4DrTAK1蛋白和DrTANK蛋白在EPC细胞与HEK-293T细胞中的表达情况。将带有Flag标签的DrTAK1质粒或带有Flag标签的DrTANK质粒转染到（A、C）HEK293T细胞和（B、D）EPC细胞中，设置的对照组转染空载体（pcDNA5-FRT/TO），48h后，收集EPC细胞和HEK-293T细胞并将这两种细胞充分裂解，然后用免疫印迹法（Western-blot）分析全细胞裂解液，用Flag抗体检测DrTAK1蛋白和DrTANK蛋白在EPC细胞和HEK-293T细胞内的表达情况，Actin作为内参。Fig.3-3:ExpressionofDrTAK1andDrTANKproteinsinEPCcellsandHEK-293Tcells.Theflag-taggedDrTAK1plasmidortheflag-taggedDrTANKplasmidweretransfectedinto(A,C).HEK-293Tcellsand(B,D)EPCcells.Thecontrolgroupwassettotransfectanemptyvector(pcDNA5-FRT/TO).Actinwasusedtoaninternalreference.After48h,EPCcellsandHEK-293Tcellswerecollectedandfullylysed.Thewholecelllysateswereusedforimmunoblot(IB)assay.DrTAK1proteinandDrTANKproteinweredetectedinEPCcellsandHEK-293TcellswithFlagantibody.3.4DrTAK1蛋白和DrTANK蛋白在EPC细胞内的位置根据以往的研究结果，本研究猜测DrTAK1和DrTANK应该也是一种胞质蛋白；为探究DrTAK1和DrTANK在鱼类细胞中的

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本文编号：3607870