多位点整合转rhPA基因兔的乳腺特异性表达及溶栓活性试验

发布时间：2022-01-26 14:27

　　转基因动物乳腺生物反应器制药已经走向产业化,在国外,部分医用蛋白已经进入临床应用。由于哺乳动物乳腺上皮细胞对重组蛋白的加工、修饰作用,该方法生产的药用蛋白生物活性高。血栓性疾病严重威胁到了人类的生命健康,其具有很高的发病率、死亡率。溶栓药是目前临床上治疗血栓疾病比较常用的方法。重组人组织纤溶酶原激活剂（rhPA）是第三代溶栓药物,有很好的溶栓效果,但均为原核表达产品,并且无自主知识产权。本实验设计了新颖rhPA乳腺特异性表达载体,用于制备双位点整合或单位点转基因兔。获得的乳腺特异性rhPA表达产物经纯化和动物试验表明已经获得了乳腺特异性高表达转基因兔和具有高效溶栓活性的rhPA,为创制具有自主知识产权的高效新颖溶血栓生物药奠定了基础。构建载体的基本元件为实验室保存的PCL-25/LTF-Neo和自行设计的rhPA基因片段。PCL-25/LTF-Neo通过Nhe Ⅰ酶切,切胶回收获得Neor基因片段,PCL-25/rhPA质粒用Nhe Ⅰ酶切胶回收获得线性化的片段。将线性化的PCL-25/rhPA片段和Neor基因片段用T4 DNA连接酶连接,获得PCL-25/rhPA-Neo质粒。将其... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文名称及缩写词
第一章 文献综述
    1. 溶栓药物的发展
    2. 乳腺生物反应器概述
        2.1 腺生物反应器原理
        2.2 转基因动物乳腺生物反应器制药的优点
        2.3 利用乳腺生物反应器生产重组t-PA的研究进展
        2.4 家兔作为乳腺生物反应器的优势
        2.5 显微注射法制备乳腺生物反应器
    3. 人组织纤溶酶原激活剂概述
        3.1 人组织纤溶酶原激活剂的发展历史
        3.2 人组织纤溶酶原激活剂基因序列分析
        3.3 人组织纤溶酶原激活剂机构与功能分析
        3.4 人组织纤溶酶原激活剂变构体
    4. 多基因表达研究
        4.1 转基因整合位点机制的概述
        4.2 外源基因的表达水平与整合位点的位置效应
        4.3 多基因共表达的方式
        4.4 单基因载体多重转化
    5. 血栓动物模型制备的方法
        5.1 物理损伤法
        5.2 化学损伤法
第二章 乳腺特异性表达rhPA基因载体的构建
    1. 材料
        1.1 菌种及质粒
        1.2 主要仪器和设备
        1.3 分子生物学试剂
        1.4 主要试剂的配制
    2. 方法
        2.1 大量提取PCL25/LTF-Neo质粒以及PCL25/rhPA质粒
        2.2 从PCL25/LTF-Neo质粒中获取Neo~r基因和PCL25+rhPA质粒的线性化
        2.3 Neo~r基因片段插入PCL25/rhPA载体
        2.4 连接产物的转化以及重组质粒PCL-25/rhPA-Neo的酶切鉴定
        2.5 显微注射片段PCL-25/rhPA-Neo的回收
    3. 结果
第三章 多位点整合转rhPA基因兔的制备及其整合表达检测
    1. 材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验仪器
        1.3 主要器材
        1.4 主要药品与试剂
        1.5 主要试剂的配制
    2. 实验方法
        2.1 用FSH/hCH对供体母兔进行超数排卵
        2.2 用hCG对供受体母兔进行同期发情处理
        2.3 超数排卵的供体母兔与转PCL25/tPA公兔配种
        2.4 手术法收集供体母兔受精卵
        2.5 原核期兔受精卵显微注射PCL-25/rhPA-Neo基因片段
        2.6 原核期兔受精卵显微注射PCL-25/rhPA-Neo基因片段后移植受体母兔
        2.7 受体母兔术后护理以及分娩
        2.8 转基PLC-25/rhPA-Neo基因兔的整合检测
        2.9 转基因兔的配种及表达检测
    3. 结果
        3.1 转rhPA基因兔基因组PCR整合检测
        3.2 转rhPA基因兔兔奶ELISA检测
        3.3 转rhPA基因兔兔奶FAPA检测结果
第四章 小鼠血栓模型的建立及其体内溶栓试验
    1. 材料
        1.1 实验动物
        1.2 主要试剂
        1.3 仪器和材料
    2. 方法
        2.1 rhPA的纯化及其去除内毒素
        2.2 角叉菜胶制备小鼠尾部血栓模型
        2.3 重组产物rhPA治疗小鼠尾血栓试验
    3. 结果
        3.1 不同浓度角叉菜胶诱导小鼠尾血栓形成结果
        3.2 不同浓度纯化产物rhPA溶解小鼠尾部血栓试验结果
讨论
全文总结
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建[J]. 张斯敏,高越,方彧聃,张金脉,张敬之.  中国生物工程杂志. 2014(07)
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[4]人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）突变体的研究现状及进展[J]. 江成英,郭宏文,冮洁.  农产品加工(学刊). 2008(07)
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[8]溶栓药物研究新进展[J]. 杜平中.  中国新药杂志. 2001(08)
[9]绿光光照诱导大鼠脑血栓模型后脑组织病理与行为学改变的研究[J]. 杨文清,王俊卿,任东青.  现代康复. 2001(07)
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博士论文
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[2]乳蛋白与CMV复合启动子驱动hLF cDNA乳腺特异性表达[D]. 成勇.南京农业大学 2007
[3]蚓激酶表达产物活性在动物体内的检测[D]. 卜秀娟.吉林大学 2007
[4]利用精子载体方法研制人组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因羊乳腺生物反应器[D]. 叶华虎.中国人民解放军军事医学科学院 2005

硕士论文
[1]含RGD序列的抗栓溶栓药物的研究和应用进展[D]. 景丽丽.重庆医科大学 2010



本文编号：3610649