APN基因编辑猪生产及其对TGEV和PEDV抗性的研究

发布时间：2022-07-11 15:37

　　猪肠道疾病是全球养猪业的主要威胁,已造成重大的经济损失。包括传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）在内的多种冠状病毒,已确定为猪肠道疾病的主要病原体,但对于这些疾病的防控依然缺乏有效手段。TGEV和PEDV的宿主细胞是小肠绒毛上皮细胞,存在于该细胞表面中的氨肽酶N（Aminopeptidase-N,APN）可能是TGEV和PEDV进入细胞的受体。目前关于TGEV和PEDV与APN之间互作关系的研究主要集中在细胞水平上,并且APN是否是PEDV的细胞受体依然存在争议。因此,本研究着重于APN基因编辑仔猪是否具有抗TGEV和PEDV感染的能力,以此来探讨APN在病毒感染中的作用,从而为抗病育种提供一些参考。首先,本研究利用CRISPR/Cas9n基因编辑系统,通过细胞转染,并结合流式细胞仪筛选出GFP表达的细胞,通过细胞培养获得单克隆细胞系,随机挑选19个单克隆,其中16个为APN双等位基因编辑,编辑效率为84.3%,基因编辑形式包括D... 

【文章页数】：109 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
    1 基因编辑技术概述
        1.1 基因编辑历史简述
        1.2 锌指核酸酶
        1.3 类转录激活因子效应物核酸酶
        1.4 CRISPR/Cas9系统
        1.5 不同基因编辑方法的优缺点
    2 基因编辑技术在畜牧生产中的应用
        2.1 基因编辑动物的生产方法
            2.1.1 原核注射
            2.1.2 慢病毒载体法
            2.1.3 精子载体法
            2.1.4 体细胞核移植
            2.1.5 胞质注射
        2.2 基因编辑技术在家畜生产中的应用
            2.2.1 改善家畜生产性能
            2.2.2 提高抗病性
            2.2.3 改良奶品质量
            2.2.4 建立人类疾病的动物模型
    3 仔猪腹泻与氨肽酶N的研究概述
        3.1 氨肽酶N概述
        3.2 猪冠状病毒概述
        3.3 猪冠状病毒发病机制和临床症状
        3.4 猪冠状病毒的免疫反应
        3.5 猪氨肽酶N与猪冠状病毒之间的关系
    4 研究目的与意义
第二章 利用CRISPR/Cas9n基因编辑系统建立APN基因编辑猪胎儿成纤维系
    引言
    1 材料与方法
        1.1 细胞与载体
        1.2 主要试剂和耗材
            1.2.1 主要试剂
            1.2.2 主要耗材
            1.2.3 试剂配制
        1.3 主要仪器设备
        1.4 实验方法
            1.4.1 设计针对APN基因的sgRNA
            1.4.2 sgRNA双链退火
            1.4.3 构建单独表达sgRNA-A213和sgRNA-A258的质粒载体
            1.4.4 构建同时表达sgRNA-A213和sgRNA-A258的质粒载体
            1.4.5 琼脂糖凝胶回收
            1.4.6 质粒纯化
            1.4.7 猪胎儿成纤维细胞培养
            1.4.8 细胞转染及筛选
            1.4.9 基因组提取
            1.4.10 APN基因编辑细胞克隆点的鉴定及基因型分析
    2 结果与分析
        2.1 猪APN基因编辑载体的构建分析
        2.2 APN基因编辑猪胎儿成纤维细胞的筛选与鉴定
    3 讨论
    4 小结
第三章 APN基因编辑克隆猪生产
    引言
    1 材料与方法
        1.1 主要试剂与耗材
            1.1.1 主要试剂
            1.1.2 试剂配制
            1.1.3 主要耗材
        1.2 主要仪器设备
        1.3 实验方法
            1.3.1 猪卵母细胞体外成熟
            1.3.2 体细胞核移植卵母细胞及供体细胞准备
            1.3.3 体细胞核移植
            1.3.4 重构胚胎的融合、激活和培养
            1.3.5 卵母细胞孤雌激活
            1.3.6 APN基因编辑猪耳成纤维细胞系建立
            1.3.7 胚胎移植
            1.3.8 APN基因编辑克隆猪的基因型鉴定
            1.3.9 蛋白免疫印迹
    2 结果与分析
        2.1 APN基因编辑对核移植胚胎发育的影响
        2.2 胚胎移植和仔猪生产
        2.3 APN基因编辑克隆猪的DNA和蛋白鉴定
    3 讨论
    4 小结
第四章 APN基因编辑仔猪对TGEV和PEDV的抗性研究
    引言
    1 材料与方法
        1.1 细胞与病毒
        1.2 主要试剂与耗材
            1.2.1 主要试剂
            1.2.1 主要耗材
        1.3 主要仪器设备
        1.4 实验方法
            1.4.1 病毒培养
            1.4.2 APN基因编辑仔猪攻毒前准备
            1.4.3 APN基因编辑仔猪攻毒
            1.4.4 APN基因编辑仔猪攻毒分组
            1.4.5 观察发病情况
            1.4.6 病理剖解
            1.4.7 肠道组织苏木素-伊红(HE)染色及免疫组化
            1.4.8 酶联免疫吸附测定(ELISA)粪便及肠道内容物中病毒含量
            1.4.9 荧光定量PCR检测粪便及肠道内容物中病毒RNA含量
        1.5 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 APN基因编辑猪TGEV攻毒结果
        2.2 APN基因编辑猪PEDV攻毒结果
    3 讨论
    4 小结
全文结论
参考文献
附录
    附表
    附图
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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硕士论文
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[3]小鼠受精卵显微注射技术的优化以及Trex1敲除小鼠的构建[D]. 韦剑辉.福建师范大学 2016
[4]TGEV感染的ST细胞mRNA和lncRNA表达谱变化及其功能预测[D]. 潘开源.安徽农业大学 2016
[5]TALENs介导的山羊BLG基因敲除和hLF基因敲入的研究[D]. 朱孟敏.扬州大学 2016
[6]CRISPR/CAS9与TALENs介导奶山羊β-酪蛋白位点基因打靶效率的比较研究[D]. 刘畅.内蒙古大学 2016
[7]利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究[D]. 陈建文.安徽农业大学 2012
[8]猪克隆胚胎生产技术及组蛋白乙酰化免疫荧光染色技术优化[D]. 曹祖兵.安徽农业大学 2010



本文编号：3658424