基于转录组和全基因组甲基化联合分析的大鼠睾丸间质细胞及成纤维细胞中雄激素合成通路关键基因表达的调控研究

发布时间：2022-08-01 13:41

　　睾丸间质细胞（Leydig Cell,LC）是雄性个体雄激素的主要来源,雄激素对男性生殖系统的发育及男性生殖功能的维持具有决定性作用。DNA甲基化是核酸表观遗传修饰的主要表现方式之一,能在转录水平上调控靶标基因的表达。到目前为止,尚未有研究在表观遗传方面对LC雄激素合成通路关键酶的表达及对雄激素分泌调控方面进行报道。本研究首先分离不同发育阶段的睾丸间质祖细胞（PLC）、睾丸间质未成熟细胞（ILC）以及睾丸间质成熟细胞（ALC）,同时以大鼠尾部成纤维细胞（TTF）作为对照,利用转录组测序RNA-seq技术和基因组甲基化测序RRBS技术相结合的方法,分析不同发育阶段LC细胞转录水平的变化和基因组DNA甲基化图谱差异,探索在LC发育过程中基因组DNA甲基化对雄激素合成通路关键酶基因表达的表观遗传调控机制,为了解LC谱系发育过程、雄激素合成调控机制及日后利用成体细胞重编程为具有功能的类睾丸间质细胞提供科学依据。本研究的主要结果如下:1、对不同发育阶段的LC（PLC、ILC、ALC）及TTF 8个样本（2个重复）进行转录组测序,最终平均各样本获得6.60Gb数据。共检测出15852个基因在LC中... 

【文章页数】：130 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 睾丸间质细胞的功能及发育分化
        1.1.1 LC分类和功能
        1.1.2 LC类固醇生成途径
        1.1.3 LC的分化调控和类固醇生成调节
    1.2 成纤维细胞研究简介
    1.3 DNA甲基化研究简介
        1.3.1 DNA甲基化调控机制及作用
        1.3.2 DNA甲基化检测方法
    1.4 转录组学研究简介
    1.5 研究内容、目的及意义
第二章 PLC、ILC、ALC及 TTF的转录组分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 实验用具与耗材
        2.1.4 实验仪器
        2.1.5 溶液配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 雄性SD大鼠原代PLC、ILC、ALC分离
        2.2.2 雄性SD大鼠TTF分离
        2.2.3 总RNA提取
        2.2.4 总RNA质量检测
        2.2.5 RNA-seq文库构建
        2.2.6 RNA-seq文库质检与上机测序
    2.3 生物信息学分析方法
        2.3.1 测序数据质控分析
        2.3.2 差异表达基因分析
        2.3.3 差异表达基因GO功能注释和富集分析
        2.3.4 差异表达基因KEGG pathway富集分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 总RNA质量检测
        2.4.2 RNA-seq碱基质量值
        2.4.3 RNA-seq碱基含量分布
        2.4.4 RNA-seq数据随机性检验
        2.4.5 RNA-seq数据饱和度检验
        2.4.6 Unique mapped reads在参考基因组上的分布
        2.4.7 RNA-seq数据产出及与参考基因组比对分析
        2.4.8 不同发育阶段LC(PLC、ILC、ALC)差异表达基因的分析
        2.4.9 PLC、ILC、ALC与 TTF的差异表达基因分析
        2.4.10 LC各发育阶段(PLC、ILC、ALC)差异表达基因GO和 KEGG pathway富集分析
        2.4.11 PLC、ILC、ALC与 TTF的差异表达基因GO和 KEGG Pathway富集分析
第三章 PLC、ILC、ALC及 TTF的简化甲基化图谱分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 实验耗材
        3.1.4 主要试剂
        3.1.6 溶液配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 雄性SD大鼠原代PLC、ILC、ALC分离
        3.2.2 雄性SD大鼠TTF分离
        3.2.3 基因组DNA提取及质量检测
        3.2.4 RRBS文库构建
        3.2.5 RRBS文库质检与上机测序
    3.3 生物信息学分析方法
        3.3.1 RRBS数据质控分析
        3.3.2 RRBS数据与参考基因组比对分析
        3.3.3 甲基化位点检测
        3.3.4 区域甲基化水平分析
        3.3.5 差异甲基化区域(DMR)鉴定与分析
        3.3.6 差异甲基化基因(DCG)分析
    3.4 结果与分析
        3.4.1 基因组DNA质量检测
        3.4.2 RRBS碱基质量分布
        3.4.3 RRBS碱基类型分布
        3.4.4 RRBS数据统计分析
        3.4.5 RRBS测序深度分布统计
        3.4.6 CG、CHG及 CHH不同类型的甲基化位点分析
        3.4.7 基因不同功能元件甲基化水平
        3.4.8 DMR数目分析
        3.4.9 DMR在基因不同功能元件上的分布情况
        3.4.10 DMR在不同染色体上的分布情况
        3.4.11 差异甲基化基因(DCG)鉴定
第四章 PLC、ILC、ALC及 TTF全基因组甲基化与转录组联合分析
    4.1 实验方法
        4.1.1 DMR-mRNA相关性分析
        4.1.2 差异甲基化且差异表达基因GO和 KEGG pathway富集分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 LC各发育阶段甲基化组与转录组联合分析
        4.2.2 LC与 TTF甲基化组与转录组联合分析
第五章 讨论
    5.1 PLC、ILC、ALC的差异表达候选基因分析
    5.2 PLC、ILC、ALC与 TTF的差异表达候选基因分析
    5.3 DNA甲基化介导的差异表达候选基因分析
    5.4 Promoter区域甲基化介导的差异表达候选基因分析
第六章 结论、创新点与展望
    6.1 结论
    6.2 主要创新点
    6.3 展望
参考文献
附录
英文缩略词表
致谢



本文编号：3667555