豌豆蚜表皮碳氢化合物种内变异及CYP4G51基因调节其生物合成的研究

发布时间：2022-10-10 20:40

　　昆虫表皮碳氢化合物（Cuticular hydrocarbon,CHC）是沉积在昆虫体表的非极性长链脂类物质。其在维持水分平衡以及化学交流方面发挥重要作用。昆虫CHC组成谱常表现出高度的物种专一性,且可受到多种内外因素的影响而表现出种内变异,其变异来源及尺度在半翅目昆虫,尤其是具有多样种内多型的蚜虫中较少被探究。昆虫CHC是体内合成并运输到体表的产物,其生物合成途径受到复杂的多基因分子调节。作为果蝇基因组所含两个CYP4G亚家族基因之一,CYP4G1被证明参与催化CHC合成的最后一步反应。然而,CYP4G基因在其它昆虫包括刺吸式蚜虫中的具体功能还不清楚。本研究以豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）为模式系统,通过建立和优化适合蚜虫CHC提取的高效固相微萃取（Solid-phase microextration,SPME）技术,并在此基础上探究多种因素对CHC的影响,从而明确CHC种内变异的来源和尺度;通过对豌豆蚜唯一的CYP4G亚家族基因CYP4G51进行分子鉴定、功能研究以及真核表达和活性检测,明确了其在参与HC合成中的关键作用。本研究取得主要结果如下:1.基于SPME技... 

【文章页数】：107 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 昆虫碳氢化合物
        1.1.1 化学组成与结构多样性
        1.1.2 合成途径
        1.1.3 合成部位与运输
    1.2 表皮碳氢化合物
        1.2.1 主要生物学功能
        1.2.2 种内变异
        1.2.3 提取和检测方法
    1.3 昆虫P450与4G亚家族
        1.3.1 昆虫P450概述
        1.3.2 P450与碳氢化合物合成
        1.3.3 CYP4Gs研究现状
    1.4 蚜虫
    1.5 研究目的、意义及内容
        1.5.1 研究目的及意义
        1.5.2 研究内容
第二章 豌豆蚜表皮碳氢化合物种内变异
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 供试昆虫与植物
        2.2.2 主要仪器设备
        2.2.3 线粒体COI基因变异检测
        2.2.4 正己烷浸泡法提取豌豆蚜CHC
        2.2.5 豌豆蚜CHC的固相微萃取
        2.2.6 GC-MS分析
        2.2.7 数据处理与统计
    2.3 结果与分析
        2.3.1 五个地理种群线粒体COI基因变异检测
        2.3.2 不同SPME纤维头对CHC吸附效率比较
        2.3.3 SPME的可重复性及有效性
        2.3.4 不同发育阶段、翅型对CHC的影响
        2.3.5 寄主植物对CHC的影响
        2.3.6 豌豆蚜CHC在不同地理种群中的变异
    2.4 讨论
第三章 豌豆蚜碳氢化合物合成途径关键基因CYP4G51的功能研究
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 供试昆虫与植物
        3.2.2 主要设备及试剂
        3.2.3 基因序列获得与生物信息学分析
        3.2.4 耐旱性生物测定
        3.2.5 组织解剖、总RNA抽提及cDNA合成
        3.2.6 荧光定量PCR(qPCR)
        3.2.7 豌豆蚜CYP4G51基因片段的克隆
        3.2.8 dsRNA的合成
        3.2.9 dsRNA的导入及RNAi效率检测
        3.2.10 碳氢化合物的提取与色谱分析
        3.2.11 统计学
    3.3 结果与分析
        3.3.1 CYP4G51序列分析与RNAi策略
        3.3.2 CYP4G51时空表达谱分析
        3.3.3 干旱胁迫对CYP4G51表达量的影响
        3.3.4 人工饲料诱导CYP4G51的上调表达与CHC的增加
        3.3.5 dsRNA介导的CYP4G51沉默效率检测
        3.3.6 CYP4G51沉默对碳氢化合物含量的影响
        3.3.7 CYP4G51沉默对蚜虫耐旱性的影响
    3.4 讨论
第四章 CYP4G51基因的真核表达与活性检测
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 质粒与菌株
        4.2.2 主要设备和试剂
        4.2.3 细胞色素P450还原酶(CPR)的抗体制备
        4.2.4 CYP4G51-CPR融合蛋白的真核表达
        4.2.5 Sf9细胞微粒体蛋白的提取
        4.2.6 P450的CO差光谱
    4.3 结果与分析
        4.3.1 CPR原核表达载体的酶切验证
        4.3.2 CPR原核表达蛋白的纯化检测
        4.3.3 CPR多克隆抗体的特异性检测
        4.3.4 CYP4G51-CPR融合蛋白和CPR蛋白供应载体的酶切验证
        4.3.5 CYP4G51-CPR融合蛋白的Western检测
        4.3.6 CYP4G51-CPR融合蛋白的CO差光谱检测
    4.4 讨论
第五章 全文总结
    5.1 结论
    5.2 创新点
    5.3 研究展望
参考文献
附录
缩略词
致谢
作者简介及攻读学位期间所取得的学术成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]保幼激素和蜕皮激素对德国小蠊聚集信息素生物合成的影响[J]. 杨惠,张金桐,邓兵,李宏.  中国媒介生物学及控制杂志. 2008(01)
[2]桃蚜不同蚜型DNA多态性的RAPD研究[J]. 张素方,程家安,杨效文.  昆虫学报. 2002(06)



本文编号：3690316