嗜水气单胞菌LitR蛋白对毒力基因的调控机理研究

发布时间：2023-04-22 21:21

　　嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种典型的人-兽-鱼共患病病原菌,该菌释放毒力因子的过程受群体感应(quorum sensing,QS)系统的调控,嗜水气单胞菌中存在着以酰基高丝氨酸内酯(AHL)为信号分子的感应通路和以呋喃酰硼酸二酯(AI-2)为信号分子的感应通路。已有文献报道,嗜水气单胞菌中群体感应调控因子AhyRI和LuxS对LitR具有调控作用,并且LitR与已报道的7个致病菌中群体感应调控因子保守序列高度相似,因此我们推测LitR是嗜水气单胞菌群体感应双通路的响应因子,有可能作为群体感应调控因子发挥作用。本文通过研究LitR表达与细菌浓度关系、litR基因缺失对毒力基因转录表达的影响、LitR与毒力基因的体外结合,旨在探究嗜水气单胞菌中LitR蛋白对毒力基因的调控机理。首先,构建用于LitR异源表达的重组菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a-litR,IPTG诱导LitR蛋白表达,进而利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化技术对LitR蛋白进行纯化,用纯化后的LitR蛋白制备多克隆抗体,以Gap-2为内参蛋白,利用wester...

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 嗜水气单胞菌的研究近况
        1.1.1 嗜水气单胞菌简介
        1.1.2 嗜水气单胞菌群体感应系统
    1.2 响应因子LitR
    1.3 嗜水气单胞菌毒力因子
        1.3.1 溶血素
        1.3.2 胞外蛋白酶
        1.3.3 丝氨酸蛋白酶
        1.3.4 T6SS效应蛋白
    1.4 选题意义与研究内容
第二章 LitR表达与细菌浓度关系研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株及质粒
        2.1.2 主要试剂及规格
        2.1.3 主要培养基及溶液配制
        2.1.4 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 LitR蛋白的表达与纯化
            2.2.1.1 重组菌E.coli(BL21)-pET28a-litR的构建
            2.2.1.2 LitR蛋白的诱导表达
            2.2.1.3 LitR蛋白的纯化
            2.2.1.4 LitR蛋白聚合形式分析
        2.2.2 LitR抗体的制备及检测
            2.2.2.1 LitR抗体的制备
            2.2.2.2 LitR抗体的检测
        2.2.3 LitR表达的研究
            2.2.3.1 内参抗体Gap-2 的制备及检测
            2.2.3.2 LitR表达与细菌浓度关系研究
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 LitR蛋白的表达与纯化
        2.3.2 LitR抗体的制备及检测
        2.3.3 LitR表达与菌体浓度的研究
第三章 lit R基因缺失突变株的构建及其特性研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株及质粒
        3.1.2 主要试剂及规格
        3.1.3 主要培养基及溶液配制
        3.1.4 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 litR基因缺失突变株的构建
            3.2.1.1 PCR引物设计及合成
            3.2.1.2 litR基因上下游同源臂及氯霉素基因片段的获取
            3.2.1.3 litR基因缺失片段的获得
            3.2.1.4 重组菌E.coli SM10(λpir)-pWM91-ΔlitR的构建
            3.2.1.5 litR基因缺失突变株的筛选及鉴定
        3.2.2 litR基因缺失突变株的特性研究
            3.2.2.1 缺失突变株与野生株生长曲线的测定
            3.2.2.2 LitR对毒力基因调控的研究
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 litR基因缺失突变株的构建
        3.3.2 litR基因缺失突变株的特性研究
            3.3.2.1 缺失突变株与野生株生长曲线的测定
            3.3.2.2 LitR对毒力基因调控的研究
第四章 LitR与毒力基因体外结合研究
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株及质粒
        4.1.2 主要试剂及规格
        4.1.3 主要培养基及溶液配制
        4.1.4 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 LitR与毒力基因体外结合的研究
            4.2.1.1 探针制备
            4.2.1.2 EMSA实验
        4.2.2 LitR与毒力基因结合位点的研究
            4.2.2.1 探针制备
            4.2.2.2 DNase I footprinting反应
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 LitR与毒力基因体外结合的研究
        4.3.2 LitR与毒力基因结合位点的研究
结论与展望
参考文献
致谢
附录
    附录A 重组自杀质粒pWM91-ΔlitR构建示意图
    附录B 嗜水气单胞菌litR基因缺失突变株基因测序序列
    附录C 研究生期间发表的学术论文



本文编号：3798416