新塔花实时定量PCR内参基因的筛选和验证

发布时间：2025-04-14 22:28

　　 目的:筛选出新塔花在不同组织(根、茎、叶、花)及脱落酸(ABA)处理不同时间的叶片中表达相对稳定的内参基因。方法:从新塔花转录组数据中搜索到5个看家基因ZbIF3G1、ZbGAPDH1、ZbEF1γ、ZbUBC9、ZbTUBα,将其作为新塔花相对实时定量PCR候选内参基因,并设计内参引物。利用实时荧光定量PCR获得5个候选内参基因的Ct值,通过3种基于不同算法的软件(GeNorm、NormFinder和BestKeeper)对内参基因稳定性进行分析。结果:ZbGAPDH1、ZbEF1γ的表达相对更为稳定,适合作为新塔花不同组织及ABA处理的基因表达研究的内参基因,并用新塔花ZbFLS、ZbCHI基因的表达分析实验进一步验证了上述预测。结论:确定ZbGAPDH1与ZbEF1γ为适合用于新塔花定量分析的内参基因,该研究为新塔花后续相关基因表达研究奠定了基础。

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【部分图文】：

图1 新塔花总RNA的电泳检测图谱

以不同组织及ABA处理不同时间点的混合cDNA进行qRT-PCR扩增,3%琼脂糖凝胶电泳检测显示,各内参基因的长度在100～250bp之间,均具有清晰单一的特异性条带,与预期结果一致。分析实时定量PCR产物的熔解曲线,发现各内参基因都只产生单一溶解峰,重复样品间的曲线重合性较好....

图2 实时定量PCR扩增产物的特异性和溶解峰

图1新塔花总RNA的电泳检测图谱2.3.2内参基因引物的扩增效率:

图3 候选内参基因的Ct值范围

GeNorm软件根据输入的Ct值得出平均表达稳定指数M值,以此来确定稳定的内参基因。M值小于1.5,则基因相对稳定。反之,则不稳定。GeNorm分析结果表明,5个内参基因的M值都小于1.5,表明5个内参基因都比较稳定。其中ZbGAPDH1、ZbEF1γ的M值最低,稳定性较好;Zb....

图4 GeNorm软件分析5个内参基因的平均表达稳定性指数M

图3候选内参基因的Ct值范围使用NormFinder软件计算基因稳定值M,M值越小,基因越稳定。计算结果表明,ZbEF1γ的M值最低,也是所选内参基因中最稳定的。而ZbUBC9的M值最高,稳定性最差。5个内参基因稳定性从高到低依次为ZbEF1γ>ZbGAPDH1>ZbTUBα>....

本文编号：4039636