水稻木聚糖酶抑制蛋白RIXI基因表达调控初探

发布时间：2017-06-24 08:09

  本文关键词：水稻木聚糖酶抑制蛋白RIXI基因表达调控初探，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：木聚糖酶抑制剂在植物的防御过程中发挥重要作用。木聚糖酶抑制蛋白基因RIXI过表达水稻的表达谱分析结果显示RIXI过表达引起12个WRKY基因差异表达。WRKY家族是植物最大的转录因子家族之一,响应生物和非生物胁迫。RIXI启动子区域预测存在能与WRKY转录因子特异性结合的W-box顺式作用元件,推测WRKY可能对RIXI表达有调控关系。本研究选取表达谱中差异表达的转录因子OsWRKY6,OsWRKY46,研究其对RIXI的表达调控作用,探究水稻木聚糖酶抑制蛋白基因RIXI的上游调控模式。主要研究结论如下：1.稻瘟病侵染后RIXI和OsWRKY相对表达水平分析：利用荧光定量PCR分析稻瘟病G11侵染野生型水稻日本晴后,OsWRKY46、OsWRKY6和RIXI相对表达水平。结果显示,稻瘟病侵染后RIXI与OsWRKY46的表达量呈负相关模式,RIXI与OsWRKY6的表达量呈正相关模式。初步判断RIXI与WRKYI都参与了水稻抗病防御反应,RIXI对水稻的抗病防御起正调控作用,OsWRKY46可能通过抑制RIXI基因的表达负调控水稻的抗病防御过程,OsWRKY6可能正调控RIXI基因的表达。1.OsWRKY与RIXI的互作分析：酵母单杂交实验结果显示,OsWRKY46能结合RIXI启动子上的W-box序列,不能结合突变后的W-box序列,说明OsWRKY46转录因子通过直接结合RIXI启动子上的W-box顺式作用元件调控其表达。3.OsWRKY与JRIXI启动子转录激活作用：利用双荧光素酶报告系统检测转录因子OsWRKY46、Os WRKY6和靶基因RIXI启动子在烟草叶片中的转录激活作用,结果显示OsWRKY46明显抑制完整启动子启动的荧光素酶活性,但不影响缺失W-box序列启动的荧光素酶活性,说明OsWRKY46通过结合RIXI启动子W-box元件,负调控靶基因的表达；OsWRKY6明显促进完整启动子启动的荧光素酶活性,但影响缺失W-box顺式作用元件的启动子序列启动的荧光素酶活性,说明OsWRKY6蛋白能结合RIXI启动子W-box元件,正调控基因的表达。4.OsWRKY46过表达转基因水稻获得：构建Ubi::OsWRKY46过表达载体,通过农杆菌转化获得OsWRKY46超表达水稻。荧光定量PCR结果显示OsWRKY46的表达水平是野生型NIP的3倍多,OsWRKY46过表达株系中RIXI表达量与野生型相比明显下降。进一步确定转录因子与木聚糖酶抑制蛋白之间的调控作用,OsWRKY46过表达对RIXI的表达起抑制作用。同时,过表达植株的获得为后续的研究积累了材料。
【关键词】：RIXI木聚糖酶抑制蛋白 WRKY转录因子 表达调控
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 致谢10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 缩略词表15-16
• 第一章 文献综述16-30
• 1.1 木聚糖酶抑制剂简介16-20
• 1.1.1 谷物中木聚糖酶抑制剂研究进展16-17
• 1.1.2 谷物中XIP家族木聚糖酶抑制剂概述17-19
• 1.1.2.1 水稻RIXI木聚糖酶抑制剂研究概述18-19
• 1.1.3 木聚糖酶抑制蛋白对生物和非生物胁迫的响应19-20
• 1.2 木聚糖酶抑制蛋白基因信号序列和启动子序列分析20-23
• 1.3 植物转录因子概述23-28
• 1.3.1 植物WRKY转录因子概述23-24
• 1.3.2 WRKY转录因子的结构特征及分类24-26
• 1.3.2.1 WRKY转录因子的结构特征24-25
• 1.3.2.2 WRKY转录因子分类25-26
• 1.3.2.3 水稻WRKY转录因子命名26
• 1.3.3 WRKY基因的生物学功能26-28
• 1.3.3.1 生物胁迫26-27
• 1.3.3.2 非生物胁迫27-28
• 1.4 选题意义28-29
• 1.5 研究内容及目标29-30
• 第二章 RIXI、WRKY生物信息学预测及表达分析30-44
• 2.1 引言30
• 2.2 材料30-37
• 2.2.1 实验材料30
• 2.2.2 RIXI启动子序列分析30-31
• 2.2.3 OsWRKY基因查找及跨膜预测分析31
• 2.2.4 稻瘟病处理水稻31-32
• 2.2.4.1 病原菌活化及培养31
• 2.2.4.2 水稻的培养及稻瘟病接种31-32
• 2.2.5 qRT-PCR检测稻瘟病菌侵染后病程相关蛋白基因表达水平32-35
• 2.2.5.1 定量引物设计32
• 2.2.5.2 水稻总RNA提取32-33
• 2.2.5.3 逆转录和cDNA的获得33-34
• 2.2.5.4 荧光定量PCR反应34-35
• 2.2.6 烟草瞬时表达35-37
• 2.2.6.1 35S：OsWRKY46-sGFP载体的构建35-36
• 2.2.6.2 转化烟草36-37
• 2.3 结果与分析37-42
• 2.3.1 RIXI启动子分析37-38
• 2.3.2 WRKY基因及氨基酸序列分析38-39
• 2.3.3 稻瘟病侵染后WRKY相对表达水平分析39-41
• 2.3.4 OsWRKY46::GFP融合蛋白在烟草表皮细胞亚细胞定位分析41-42
• 2.4 讨论42-44
• 第三章 RIXI启动子与WRKY转录因子互作研究44-61
• 3.1 引言44
• 3.2 材料和方法44-54
• 3.2.1 材料44-45
• 3.2.1.1 植物材料44
• 3.2.1.2 质粒与菌株44-45
• 3.2.2 烟草叶片瞬时表达45-50
• 3.2.2.1 RIXI-promoter::LUC载体的构建45-47
• 3.2.2.2 35S::WRKY载体的构建47-48
• 3.2.2.3 共转化烟草48-49
• 3.2.2.4 LUC含量测定49-50
• 3.2.3 酵母单杂交50-54
• 3.2.3.1 OsWRKY46：：pGADT7AD载体构建50-51
• 3.2.3.2 Prey：：pAbAi载体构建51-52
• 3.2.3.3 酵母感受态制备及转化52-53
• 3.2.3.4 RIXI promoter Prey：：pAbAi酵母验证53
• 3.2.3.5 OsWRKY46：：pGADT7-AD质粒转化53
• 3.2.3.6 酵母第二次验证53
• 3.2.3.7 涂板验证53-54
• 3.3 结果与分析54-60
• 3.3.1 烟草瞬时表达结果54-58
• 3.3.1.1 报告子RIXI promoter与pGreenⅡ 0800-LUC载体连接54-56
• 3.3.1.2 效应子OsWRKY6,OsWRKY46与pCAMBIA 1300GFP载体连接56-57
• 3.3.1.3 烟草叶片瞬时表达LUC结果57-58
• 3.3.2 酵母单杂交结果58-60
• 3.4 讨论60-61
• 第四章 水稻OsWRKY46超表达株系的获得及表达分析61-70
• 4.1 引言61
• 4.2 材料与方法61-65
• 4.2.1 材料61
• 4.2.1.1 转基因背景61
• 4.2.1.2 菌株61
• 4.2.2 超表达载体的构建以及转基因阳性苗的获得61-64
• 4.2.2.1 Ubi：：OsWRKY46超表达载体的构建61-62
• 4.2.2.2 Ubi：：OsWRKY46超表达载体的构建62-64
• 4.2.2.3 转基因苗阳性植株鉴定64
• 4.2.3 转基因水稻中OsWRKY46的相对表达水平分析64-65
• 4.2.3.1 定量引物设计65
• 4.2.3.2 水稻总RNA的提取65
• 4.2.3.3 逆转录及cDNA的合成65
• 4.2.3.4 转基因植株总RNA的qRT-PCR分析65
• 4.3 结果与分析65-69
• 4.3.1 获得目的片段OsWRKY46成熟肽序列65-66
• 4.3.2 OsWRKY46成熟肽序列成功插入pTCK303载体和转化到农杆菌中66-67
• 4.3.3 成功获得过表达转基因水稻67-68
• 4.3.4 筛选得到OsWRKY46过表达水稻阳性株系68
• 4.3.5 OsWRKY46过表达水稻中基因表达水平分析68-69
• 4.4 讨论69-70
• 第五章 全文总结及展望70-73
• 5.1 主要研究结论70-72
• 5.2 研究展望72-73
• 附录73-75
• 附录一 CM培养基配方73-75
• 参考文献75-82
• 个人简历82-83
• 硕士期间发表论文83

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1 彭耀耀;水稻木聚糖酶抑制蛋白RIXI基因表达调控初探[D];浙江大学;2016年

2 赵丽丽;水稻木聚糖酶抑制蛋白RIXI的功能初探[D];浙江大学;2011年

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本文编号：477522