外源KCS酶基因转化富油新绿藻的初步研究

发布时间：2017-08-02 02:27

  本文关键词：外源KCS酶基因转化富油新绿藻的初步研究

  更多相关文章： 富油新绿藻 微藻 KCS 农杆菌 超长链脂肪酸

【摘要】：为了探讨β-酮脂酰辅酶A合酶(KCS)在微藻超长链脂肪酸合成调控中的作用,提高微藻中的超长链脂肪酸的含量,本文以富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)为研究对象,采用农杆菌介导法将银扇草的KCS酶基因遗传转化到微藻中,并对遗传转化结果进行分析,对转化后微藻油脂的脂肪酸组成进行了分析检测,对转化KCS基因对调控微藻脂肪酸组成的作用进行了分析。本文是首次以富油新绿藻为工作对象的基因工程研究,实现了外源基因的遗传转化,此项工作为富油新绿藻的进一步基因工程研究打下了基础。本文的主要内容及结果如下:(1)研究了富油新绿藻对五种抗生素的敏感性。分别在液体培养和固体培养条件下,研究了富油新绿藻对氯霉素、青霉素、链霉素、四环素、潮霉素五种抗生素的敏感性。结果表明,在液体培养条件下,链霉素和潮霉素在浓度为10μg/m L时可以完全抑制藻细胞的生长,氯霉素和四环素在浓度为100μg/m L时表现出抑制作用,青霉素在500μg/m L才表现出轻微的抑制作用。固体培养条件的研究结果与液体培养条件的结果基本一致。(2)成功构建了2个用于农杆菌介导法遗传转化的双元表达载体。以农杆菌转化常用的质粒载体p CAMBIA1301-为基础,分别以花椰菜花叶病毒启动子Ca MV35S和莱茵衣藻偏好的融合启动子Hsp70A/Rbcs2构建KCS基因的表达盒,得到2个表达载体p CAMBIA1301-KCS、p CAMBIA1301-Rbcs2-KCS。同时,这两个载体还含有β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因和潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)作为报告基因和筛选标记基因。(3)通过携带重组质粒载体的农杆菌与富油新绿藻细胞共培养的方法,实现目标基因向富油新绿藻的遗传转化。首先,通过电转化法将重组质粒转化农杆菌,挑选出成功携带重组质粒的农杆菌菌株。然后,将携带重组质粒的农杆菌与富油新绿藻共培养,使重组质粒中的T-DNA转入富油新绿藻基因组。最后,以含潮霉素10μg/m L的培养基平板对与农杆菌共培养后的藻细胞做筛选培养,得到在筛选平板上生长的获得了潮霉素抗性的藻落。(4)对筛选出来的阳性转基因藻株进行基因检测、培养和脂肪酸分析。通过PCR检测,结果显示GUS基因、潮霉素基因、KCS基因、融合启动子都成功转入藻基因组中。通过RT-PCR检测,显示几种外源基因都成功转录。GUS染色结果显示,GUS基因成功表达,通过抗性也验证了潮霉素基因成功表达。但是,转基因藻脂肪酸组成分析表明超长链脂肪酸含量没有变化,这有待进一步分析。
【关键词】：富油新绿藻 微藻 KCS 农杆菌 超长链脂肪酸
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q949.2;TQ645.6
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 主要缩略词及其含义10-11
• 1 综述11-22
• 1.1 微藻及其应用11-13
• 1.1.1 微藻的一般生物学特点11
• 1.1.2 微藻的主要应用11-12
• 1.1.3 微藻应用的进展和问题12-13
• 1.2 富油新绿藻13-14
• 1.2.1 富油新绿藻的生物学特性13
• 1.2.2 富油新绿藻的研究进展13-14
• 1.3 KCS酶及其作用14-17
• 1.3.1 植物脂肪酸代谢调控机制14-16
• 1.3.2 KCS酶的研究进展16-17
• 1.4 微藻转基因工程研究进展17-20
• 1.4.1 微藻基因工程研究现状17-18
• 1.4.2 微藻基因工程的主要技术18-20
• 1.5 选题意义与研究主要内容20-22
• 1.5.1 选题意义20
• 1.5.2 研究内容20-22
• 2 富油新绿藻对五种抗生素敏感性研究22-30
• 2.1 材料与方法22-23
• 2.1.1 实验材料22
• 2.1.2 实验仪器22-23
• 2.1.3 实验方法23
• 2.2 结果与讨论23-29
• 2.2.1 富油新绿藻对氯霉素的敏感性23-24
• 2.2.2 富油新绿藻对青霉素的敏感性24-25
• 2.2.3 富油新绿藻对链霉素的敏感性25-26
• 2.2.4 富油新绿藻对四环素的敏感性26-27
• 2.2.5 富油新绿藻对潮霉素的敏感性27-28
• 2.2.6 讨论28-29
• 2.3 小结29-30
• 3 表达载体的构建30-38
• 3.1 材料与方法30-35
• 3.1.1 实验材料30-31
• 3.1.2 实验仪器31
• 3.1.3 实验方法31-35
• 3.2 结果与讨论35-37
• 3.2.1 载体pCAMBIA1301-KCS的菌落PCR鉴定35-36
• 3.2.2 载体pCAMBIA1301-KCS酶切鉴定36
• 3.2.3 载体pCAMBIA1301-Rbcs2-KCS的菌落PCR鉴定36-37
• 3.2.4 载体pCAMBIA1301-Rbcs2-KCS酶切鉴定37
• 3.3 小结37-38
• 4 农杆菌介导法转化富油新绿藻38-54
• 4.1 材料与方法38-43
• 4.1.1 实验材料38-39
• 4.1.2 实验仪器39
• 4.1.3 实验方法39-43
• 4.2 结果与讨论43-52
• 4.2.1 重组质粒对农杆菌的转化43-44
• 4.2.2 含有重组质粒的农杆菌转化富油新绿藻44-45
• 4.2.3 阳性克隆藻株PCR鉴定45-48
• 4.2.4 转基因藻株RT-PCR检测48-49
• 4.2.5 转基因藻株的潮霉素基因表达验证49-50
• 4.2.6 转基因藻株的GUS基因表达验证50-51
• 4.2.7 转基因富油新绿藻脂肪酸的测定51-52
• 4.2.8 讨论52
• 4.3 小结52-54
• 5 结论与展望54-56
• 5.1 结论54
• 5.2 创新点54
• 5.3 展望54-56
• 参考文献56-66
• 致谢66-67
• 作者简介67-68
• 导师简介68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 张丽;宋玉霞;巩檑;颉瑞霞;甘晓燕;石磊;聂峰杰;陈虞超;张国辉;;农杆菌介导的马铃薯转化研究进展[J];分子植物育种;2015年07期

2 孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星;;农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究[J];西北农业学报;2015年01期

3 于洋;侯文胜;韩天富;;农杆菌介导大豆遗传转化技术的研究进展[J];大豆科学;2010年04期

4 夏晗;王兴军;李孟军;肖寒;;利用基因工程改良植物脂肪酸和提高植物含油量的研究进展[J];生物工程学报;2010年06期

5 贺春萍;林春花;廖奇亨;李锐;郑服丛;;稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选[J];热带作物学报;2007年01期

6 张彬;丁在松;张桂芳;石云鹭;王金明;方立锋;郭志江;赵明;;根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究[J];作物学报;2007年03期

7 王峰;黄璐圆;;双元Ti载体的发展[J];西北植物学报;2006年11期

8 刘学铭,梁世中;小球藻的保健和药理作用[J];中草药;1999年05期

9 刘巧泉,张景六,王宗阳,洪孟民,顾铭洪;根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立[J];植物生理学报;1998年03期

，

本文编号：607278