中国樱桃花芽油菜素内酯合成相关基因克隆与功能分析

发布时间：2017-08-06 07:16

  本文关键词：中国樱桃花芽油菜素内酯合成相关基因克隆与功能分析

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【摘要】：樱桃(Prunnes pseudocerasus)属于蔷薇科李亚科落叶乔木果树,中国樱桃品种繁多,浙江地区的‘短柄’樱桃以其自花结果性好、早产、果实相对比较大、丰产、适应性强等优点成为该地区主要优良栽培品种之一,也是重要的科研材料。对于落叶果树而言,只有满足需冷量,才能正常开花,否则会导致开花不整齐,影响果实的品质与产量。近年来,落叶果树休眠及其调控机制已成为研究的热点,对自然休眠的调控也成为落叶果树栽培过程中亟待解决的问题。伴随着分子生物学的不断发展,人们对落叶果树休眠的研究已经深入到分子水平。大量研究表明,休眠的各个阶段受内源激素(ABA、IAA、GA等)调控。油菜素内酯为固醇类激素,在解除种子休眠促进萌发、细胞分裂、细胞伸长、生殖器官形成及光形态建成等方面具有重要的作用。但在落叶果树花芽休眠与休眠解除过程中的作用与调控机制报道较少,因此,本研究对油菜素内酯在花芽休眠解除中的作用做了探讨。本研究从中国樱桃转录组数据库(GeneBank登录号SRX695147)中获得4个油菜素内酯合成基因,并通过生物信息学分析、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、瞬时表达、遗传转化等技术,对其表达与功能进行了研究,主要研究结果如下：(1)通过对中国樱桃转录组数据库进行筛选,从中获得4个油菜素内酯合成基因,基因编号分别为Unigene12256、Unigene2085、Unigene2065和Unigene5028。通过对其进行蛋白质二级结构、疏水性及同源性比对等生物信息学分析,发现它们分别与梅和苹果等植物的DET2、BR6ox、DWF4和CPD同源性很高,因此将它们分别命名为Unigene12256(PpcDET2)、Unigene2085(PpcBR6ox)、Unigene2065(PpcDWF4)、 Unigene5028 (PpcCPD)。(2)分别对休眠的樱桃枝条和叶片进行不同处理,通过实qRT-PCR检测发现,随着低温的积累,PpcDWF4的表达量变化无规律,PpcCPD的表达量下调,而PpcDET2和PpcBR6ox基因的表达量都上调,但是PpcBR6ox基因上调比较显著,高达39倍。因此推测PpcBR6ox基因可能通过响应低温积累参与樱桃花芽休眠状态调控。(3)为了进一步探索PpcBR6ox基因的表达调控与低温的关系,采用常规PCR技术从樱桃基因组DNA中分离了PpcBR6ox基因启动子,通过PlantCare在线软件预测分析发现该启动子内部含有低温响应、光响应等作用元件。通过构建pGreenⅡ0800-Luc瞬时表达载体,通过与CBF转录因子互作研究,发现LUC与REN比值比阴性对照高3.5倍,说明PpcBR6ox基因启动子与CBF转录因子存在明显互作关系。推测PpcBR6ox基因被低温诱导表达可能是通过CBF信号途径介导的。(4)为了进一步确定PpcBR6ox基因功能,从中国樱桃花芽中克隆了PpcBR6ox基因cDNA全长序列,并构建了超表达载体,利用农杆菌介导的花序浸染法遗传转化拟南芥,通过潮霉素B筛选,PCR检测,获得PpcBR6ox转基因拟南芥株系。分别对转基因拟南芥和野生型拟南芥种子进行萌发试验,发现萌发48 h后,转基因拟南芥种子的萌发率接近90%,野生型种子的萌发率仅为10%左右,转基因种子的萌发率明显高于野生型。说明拟南芥中超量表达PpcBR6ox基因有助于种子休眠解除,促进种子萌发。我们推测PpcBR6ox基因可能也会促进樱桃花芽休眠解除,促进萌发。(5)为研究PpcBR6ox基因表达与芽休眠的关系,又将PpcBR6ox基因通过农杆菌介导的叶盘转化法遗传转化毛白杨,经抗性筛选和PCR鉴定,已获得了48株转基因杨树幼苗,为下一步研究PpcBR6ox基因对毛白杨侧芽生长发育和休眠的影响奠定了基础。
【关键词】：中国樱桃 休眠 油菜素内酯 PpcBR6ox基因 启动子
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S662.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略词9-14
• 第一章 文献综述14-25
• 1 油菜素内酯的分布14-15
• 2 油菜素内酯的合成15-16
• 3 油菜素内酯的合成途径的调节16-17
• 4 油菜素内酯的信号转导机制17-20
• 4.1 油菜素内酯在质膜上的受体-BRI1和BAK117-18
• 4.2 BR信号的导出18
• 4.3 BR信号的传递18-20
• 5 油菜素内酯在植物生长发育中的作用20-22
• 5.1 油菜素内酯促进细胞分裂、细胞伸长20-21
• 5.2 油菜素内酯促进维管束发育21
• 5.3 油菜素内酯调控植物的生殖发育21
• 5.4 油菜素内酯促进种子萌发21-22
• 5.5 油菜素内酯提高植物对外界环境的胁迫反应22
• 5.6 油菜素内酯促进农作物的生长发育22
• 6 落叶果树休眠机理22-23
• 7 研究目的及意义23-25
• 第二章 中国樱桃油菜素内酯合成相关基因克隆与分析25-33
• 1 前言25-26
• 2 材料与方法26-27
• 2.1 植物材料26
• 2.2 酶及相关试剂盒26
• 2.3 基因序列获取26
• 2.4 油菜素内酯合成基因生物信息学分析26-27
• 3 结果与分析27-31
• 3.1 中国樱桃油菜素内酯合成相关基因生物信息学分析27-30
• 3.2 中国樱桃油菜素内酯合成基因系统进化树分析30-31
• 4 讨论31-33
• 第三章 中国樱桃花芽油菜素内酯相关合成基因的表达分析33-51
• 1 前言33-34
• 2 材料与方法34-40
• 2.1 材料34
• 2.1.1 植物材料34
• 2.1.2 载体与菌株34
• 2.1.3 试剂34
• 2.2 方法34-37
• 2.2.1 RNA的提取34-35
• 2.2.2 cDNA一链的合成35-36
• 2.2.3 基因组DNA的提取36-37
• 2.3 樱桃油菜素内酯合成基因的表达分析37-40
• 2.3.1 材料的处理37
• 2.3.2 樱桃油菜素内酯合成基因的表达分析37-38
• 2.3.3 中国樱桃PpcBR6ox基因的分离38
• 2.3.4 中国樱桃PpcBR6ox基因启动子的分离38-39
• 2.3.5 PpcBR6ox基因启动子瞬时表达载体的构建39
• 2.3.6 瞬时表达分析39-40
• 3 结果与分析40-49
• 3.1 樱桃花芽休眠过程中油菜素内酯合成基因的表达分析40-44
• 3.1.1 樱桃花芽总RNA的提取40-41
• 3.1.2 低温处理下樱桃花芽中油菜素内酯合成基因的表达分析41-42
• 3.1.3 低温黑暗处理下樱桃花芽中油菜素内酯合成基因的表达分析42-43
• 3.1.4 低温处理下樱桃叶片中PpcBR6ox基因的表达分析43-44
• 3.2 PpcBR6ox基因的分离44
• 3.3 PpcBR6ox基因启动子功能初探44-49
• 3.3.1 PpcBR6ox基因启动子的分离44-45
• 3.3.2 PpcBR6ox基因启动子生物信息学分析45-46
• 3.3.3 PpcBR6ox基因启动子表达载体的构建46-47
• 3.3.4 PpcBR6ox基因启动子瞬时表达分析47-48
• 3.3.5 PpcBR6ox基因启动子相互作用关系的研究48-49
• 4 讨论49-51
• 第四章 中国樱桃PpcBR6ox基因功能研究51-65
• 1 前言51
• 2 材料与方法51-56
• 2.1 植物材料51-52
• 2.2 载体与菌株52
• 2.3 试剂52
• 2.4 相关培养基的配置52-53
• 2.4.1 拟南芥遗传转化相关培养基52
• 2.4.2 毛白杨遗传转化相关培养基52-53
• 2.5 中国樱桃PpcBR6ox基因超表达载体的构建53-54
• 2.6 拟南芥的遗传转化及筛选54-55
• 2.6.1 农杆菌介导的花序浸染法遗传转化拟南芥54
• 2.6.2 T_0代拟南芥潮霉素抗性种子的筛选54-55
• 2.7 农杆菌介导的叶盘转化法转化毛白杨55-56
• 2.7.1 外植体的获得55
• 2.7.2 获取菌液55
• 2.7.3 侵染55
• 2.7.4 筛选55-56
• 2.7.5 诱导不定芽56
• 2.7.6 不定芽生根56
• 2.7.7 炼苗及移栽56
• 2.7.8 抗性苗的检测56
• 3 结果与分析56-63
• 3.1 樱桃PpcBR6ox基因超表达载体的构建56-57
• 3.2 转基因拟南芥的获得及表型分析57-61
• 3.2.1 潮霉素抗性苗的基因组DNA的提取及分子检测57-58
• 3.2.2 光照长度对转基因拟南芥种子萌发的影响58-61
• 3.3 杨树遗传转化61-62
• 3.4 转基因毛白杨的鉴定62-63
• 4 讨论63-65
• 展望65-66
• 参考文献66-74
• 附录 基因序列74-78
• 攻读学位期间取得的研究成果78-80
• 致谢80-84

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本文编号：628902