平潭水仙组培快繁和抗病基因的克隆与转化

发布时间：2017-08-08 14:11

  本文关键词：平潭水仙组培快繁和抗病基因的克隆与转化

  更多相关文章： 平潭水仙 组培快繁 几丁质酶基因 葡聚糖酶基因 遗传转化

【摘要】：中国水仙(Narcissus tazetta var. chinensis M. Roem.)属石蒜科,水仙属,著名观赏植物物种,型色香独特,极具观赏价值,长久以来为十大名花之一。我国水仙主要分布在福建和浙江等地,福建水仙生产地位尤为突出,平潭岛水仙花资源丰富,独具特色,以“花期长、香味持久、植株矮壮”的三大特点著称,且人工驯化时间不长,在观赏品质培育方面可塑性更强。本实验以平潭水仙为材料,建立高效的组织快繁体系；成功从平潭水仙中克隆了两个抗病基因,即几丁质酶基因和葡聚糖酶基因,并采用农杆菌介导法进行了基因转化,获得了转基因平潭水仙植株材料。主要研究结果如下。1、子房诱导愈伤组织途径：以子房为外植体诱导产生愈伤组织速度快、质量好；可以较好的分化形成小鳞茎。本实验对含不同配比的6-BA和2,4-D的MS诱导培养基进行了筛选,在以子房为外植体的情况下可以诱导出2种不同类型的愈伤组织,黄色褶皱型和混合型,后者更为常见；实验中所设计的不同配方培养基均可诱愈伤组织的形成,其中MS+0.75 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D诱导率最高,可达79.2%; MS+5.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA愈伤组织分化率最高,可达42.4%,分化系数为2.07; MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L NAA愈伤组织分化率为30.3%,分化系数高达3.18,且小鳞茎分化质量较好；分化过程中会出现组织褐化和小鳞茎玻璃化等异常现象。2、鳞茎盘直接诱导途径：以平潭水仙鳞茎盘为外植体进行不定芽诱导,实验中对外植体消毒时间和消毒试剂NaClO的浓度进行了筛选,以6-BA、2,4-D、NAA为变量设计诱导培养基配方。结果显示：选用侧球,用30%的NaClO消毒35 mmin,污染率较低,为39.1%；添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS培养基诱导鳞茎盘产生不定芽的效果最好,63%的外植体可成功分化,分化系数为6.6；实验中发现诱导形成小鳞茎的大小依据不同培养基配方而异；每组培养基中的鳞片都会有不同程度的生长异常,鳞茎盘的继代培养效果不佳。3、花葶直接诱导途径：以平潭水仙花葶为外植体可直接诱导形成不定芽,含5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS培养基对花葶不定芽的诱导效果最好,MS+4mg/L6-BA +0.2mg/L NAA培养基中可促进分化的幼苗正常生长。4、平潭水仙抗病基因的克隆：依据中国水仙转录组测序数据,运用RT-PCR技术从平潭水仙中克隆了葡聚糖酶基因和几丁质酶基因；葡聚糖酶基因的ORF为：1887bp,共编码628个氨基酸,具有Glyco-hydro-9结构域；几丁质酶基因ORF为：918bp,编码305个氨基酸,具有Chitinase-Glyco-hydro-19结构域。5、平潭水仙抗病基因的转化：利用In-Fusion技术构建表达载体pBI121-glucanase和pB1121-chitinase,用农杆菌介导法将其分别导入平潭水仙,通过提取抗性组织DNA进行PCR验证,结果显示为阳性,初步证明了相关基因已成功导入。
【关键词】：平潭水仙 组培快繁 几丁质酶基因 葡聚糖酶基因 遗传转化
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S682.21
【目录】：

• 缩略词表7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 第一章 前言12-20
• 1 平潭水仙资源概况12-14
• 2 中国水仙离体组织再生研究14-16
• 2.1 通过愈伤组织再生途径14-15
• 2.2 通过直接诱导小鳞茎再生途径15-16
• 2.2.1 鳞茎盘的消毒15-16
• 2.2.2 影响鳞茎再生的因素16
• 3 中国水仙遗传转化概况16-17
• 4 植物抗病基因工程的研究17-18
• 5 本研究的目的意义、内容及技术路线18-20
• 5.1 目的意义18
• 5.2 主要研究内容18-19
• 5.3 技术路线19-20
• 第二章 平潭水仙花组培快繁20-31
• 1 材料与方法20-23
• 1.1 植物材料20
• 1.2 试验方法20-23
• 1.2.1 外植体的预处理和消毒20
• 1.2.2 培养基及培养条件20-21
• 1.2.3 水仙外植体的筛选21
• 1.2.4 子房愈伤组织的诱导与分化21-22
• 1.2.5 鳞茎盘不定芽的诱导22-23
• 1.2.6 花葶不定芽的诱导23
• 1.2.7 数据计算23
• 2 结果与分析23-28
• 2.1 水仙外植体的筛选23-24
• 2.2 子房愈伤组织的诱导与分化24-26
• 2.2.1 子房愈伤组织的诱导24-25
• 2.2.2 子房愈伤组织的分化25-26
• 2.3 鳞茎盘直接诱导不定芽26-28
• 2.4 花葶直接诱导不定芽28
• 3 讨论28-31
• 3.1 水仙不同外植体的消毒方法28-29
• 3.2 激素配比对水仙外植体分化的影响29-30
• 3.3 鳞茎的生根与移栽30-31
• 第三章 中国水仙抗病基因的克隆31-44
• 1 材料及方法31-32
• 1.1 试验材料31
• 1.1.1 植物材料31
• 1.1.2 菌株、载体、试剂和试验引物31
• 1.2 方法31-32
• 1.2.1 材料处理32
• 1.2.2 总RNA的获得和检测及cDNA的合成32
• 1.2.3 目的基因的PCR扩增32
• 1.2.4 目的片段的回收纯化、连接、转化及鉴定32
• 1.2.5 目的基因生物信息学分析32
• 2 结果与分析32-42
• 2.1 葡聚糖酶基因的克隆和分析32-38
• 2.1.1 葡聚糖酶基因的克隆32-35
• 2.1.2 葡聚糖酶基因生物信息学分析35-38
• 2.2 几丁质酶基因的克隆和分析38-42
• 2.2.1 几丁质酶基因序列分析38-40
• 2.2.2 几丁质酶基因生物信息学分析40-42
• 3 讨论42-44
• 第四章 平潭水仙抗病相关基因的遗传转化44-51
• 1 试验材料44
• 1.1 植物材料44
• 1.2 质粒、菌株和试剂44
• 1.3 培养基和培养条件44
• 2 试验方法44-47
• 2.1 水仙花葶的卡那霉素敏感性实验44
• 2.2 载体构建44-46
• 2.2.1 目的基因的获得44-45
• 2.2.2 pBI121质粒制备及酶切45
• 2.2.3 目的片段与表达载体的连接、转化和检测45
• 2.2.4 载体构建流程45-46
• 2.3 转基因植株的获取与检测46-47
• 2.3.1 农杆菌GV3101的活化和感受态制备46-47
• 2.3.2 重组质粒转化农杆菌47
• 2.3.3 农杆菌侵染和抗性再生芽的获得47
• 2.3.4 转基因植株的PCR检测47
• 3 结果与分析47-49
• 3.1 水仙花葶的卡那霉素敏感性实验48
• 3.2 表达载体的构建结果48
• 3.3 抗性再生不定芽的PCR鉴定48-49
• 4 讨论49-51
• 小结与展望51-53
• 参考文献53-57
• 附录：图版和图版说明57-63
• 致谢63

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 高尚士;新春岁首话水仙[J];新农业;2000年02期

2 蔡兴华;水仙栽培及花期控制[J];福建果树;2002年S1期

3 李盛仙;水仙一盆满堂春[J];绿化与生活;2004年06期

4 高扬帆;王建华;秦雪峰;李淑恒;;不同浓度的跟茂对水仙生长的影响[J];北方园艺;2008年03期

5 马艳丽;;水仙的园林应用现状及研究进展[J];林业勘查设计;2010年02期

6 ;漳州水仙栽培技术的研究及其试种[J];北京林学院学报;1979年00期

7 吴应祥;水仙史话[J];世界农业;1984年03期

8 ;水仙[J];新农业;1985年Z1期

9 连秉祥;;水仙造型[J];花木盆景(花卉园艺);1994年06期

10 张冬梅;卞黎霞;;水仙属植物研究现状及崇明水仙发展策略[J];园林科技;2013年04期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 杨春起;周威;崔文山;罗凤霞;;水仙栽培品种Fortissimo组培继代扩繁技术研究[A];中国园艺学会球根花卉分会2008年会暨球根花卉产业发展研讨会论文集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前9条

1 罗芒生;家养水仙 高雅呈现[N];湖南科技报;2006年

2 赵大为;水仙雕刻与花期控制[N];中国花卉报;2008年

3 马文其;水仙的选养刻[N];中国花卉报;2004年

4 黄海;养盆水仙发新春财[N];经理日报;2003年

5 ;春节水仙开 现在就备栽[N];云南科技报;2004年

6 王紫雯;漳州水仙国庆热销[N];人民政协报;2008年

7 记者 欧阳蕾昵;多样“崇明水仙”岛内岛外齐飘香[N];东方城乡报;2013年

8 国信证券研究策划中心 许翔 储诚忠;PT水仙 绝境中的反思[N];证券时报;2001年

9 刘静 胡维新 何莉芳;水仙提取物能诱导骨髓瘤细胞凋亡[N];中国医药报;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王婧雅;基于文献统计的福建特色园艺作物水仙和柚研究现状与趋势分析[D];福建农林大学;2012年

2 毕凯健;水仙环素衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性研究[D];第二军医大学;2015年

3 章萍萍;多花水仙离体培养及多倍体诱导技术研究[D];福建农林大学;2015年

4 吴雪琴;漳州水仙开花及花色基因植物表达载体构建与转化研究[D];福建农林大学;2015年

5 华静静;‘黄花水仙2号’三个WD40相关基因克隆及表达分析[D];福建农林大学;2015年

6 李科;多花水仙花香成分分析和相关基因的克隆[D];福建农林大学;2014年

7 祁世明;基于水仙BAC末端序列的SSR标记开发与应用[D];福建农林大学;2014年

8 赵潇俐;多花水仙离体快繁技术研究及WD40基因表达分析[D];福建农林大学;2016年

9 王文婷;平潭水仙组培快繁和抗病基因的克隆与转化[D];福建农林大学;2016年

10 武文琪;荷兰水仙的生长与鳞茎花芽分化及需冷性研究[D];上海交通大学;2007年

，

本文编号：640368