转1Dx5基因致小麦内源1Dx2基因沉默因素的探究

发布时间：2017-08-09 15:23

  本文关键词：转1Dx5基因致小麦内源1Dx2基因沉默因素的探究

  更多相关文章： 小麦 基因沉默 BSMV-VIGS 1Dx2基因

【摘要】：本研究以新疆耐盐小麦品种新冬26为受体材料,采用花粉管通道转基因法将1Dx5基因转入受体植株,获得转基因T0代小麦,在对其T1代种子的检测中发现有部分种子内源1Dx2基因没有表达。为此我们构建了3个大麦条斑花叶病毒(BSMV)重组载体,携带外源1Dx5基因上的部分片段去感染含有1Dx2基因的中国春小麦,以探究外源基因导入是否可以由于RNA干扰的作用引起内源基因的沉默。为转基因育种中基因沉默的现象提供理论依据,进而加快转基因育种的进程。主要研究结果如下:(1)花粉管通道法转基因条件的优化。在花粉管通道法转基因过程中,控制授粉后到基因转化之间的时间间隔,以1.0h、2.0h、3.0h、4.0h为处理,证明在处理时间为2.0h时基因转化效率最高,达到2.78%,平均转化率约0.94%,获得了转优质HMW-GS 1Dx5基因的转基因小麦。(2)转基因阳性小麦T1代种子的HMW-GS组成分析。最终育成的37个转基因株系,共收获4686粒T1代种子,其中随机挑选的1/4的种子(共1178粒)SDS-PAGE电泳,在蛋白质水平上T1代种子的HMW-GS组成出现3种表型:表型Ⅰ,外源1Dx5基因没有表达;表型Ⅱ,外源1Dx5基因表达;表型Ⅲ,内源1Dx2基因没有表达,这三种表型在不同的株系和不同的单穗中都普遍存在,分别出现的概率约为34.3%,45.9%和19.8%。(3)建立BSMV病毒诱导基因沉默的体系。以八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)为指示基因,小麦抽穗时,在穗部接种感染BSMV:PDS,同时以接种BSMV:00为对照,发现:接种BSMV:PDS的小麦穗在接种的第5-8天出现光漂白性,在第15天现象比较明显,到接种的第23-25天光漂白现象达到最大程度,而接种了BSMV:00的对照组小麦穗却没有该现象发生。实时荧光定量PCR分析接种小麦穗中PDS基因的相对表达量,结果发现:相对于接种BSMV:00的麦穗,接种BSMV:PDS后发生光漂白的麦穗中PDS基因的相对表达量明显下降。(4)BSMV病毒诱导1Dx2基因沉默。以1Dx5基因为模板克隆了3个目的基因片段,分别命名为KL-1、KL-2、KL-3,构建VIGS重组载体。小麦开花12天后,在麦穗上分别摩擦接种BSMV:KL-1、BSMV:KL-2、BSMV:KL-3,同时接种BSMV:00为对照。实时荧光定量PCR分析接种麦穗中1Dx2基因的相对表达量,结果发现:在小麦穗中接种构建的3个VIGS重组载体,其1Dx2基因的相对表达量均有所下降,证明在植物中转入同源基因,可能通过RNA干扰的作用引起内源基因的沉默,为研究转基因沉默提供理论依据。
【关键词】：小麦 基因沉默 BSMV-VIGS 1Dx2基因
【学位授予单位】：新疆师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S512.1;Q943.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 文献综述10-22
• 1.1 小麦转基因育种研究进展10-12
• 1.1.1 小麦转基因育种概况10
• 1.1.2 小麦常用的转基因方法10-12
• 1.2 小麦HMW-GS的组成与品质的关系12-14
• 1.2.1 小麦HMW-GS的组成12-13
• 1.2.2 HMW-GS与小麦面粉品质的关系13-14
• 1.3 转基因植物遗传表达的研究进展14-17
• 1.3.1 外源基因在受体植物中的表达14-15
• 1.3.2 外源基因在受体植物中的遗传15
• 1.3.3 外源基因在受体植物中的沉默15-17
• 1.4 大麦条斑花叶病毒（BSMV）诱导小麦基因沉默17-19
• 1.4.1 病毒诱导基因沉默（VIGS）的作用机制17-18
• 1.4.2 大麦条斑花叶病毒（BSMV）诱导小麦基因沉默18-19
• 1.5 研究目的、意义和内容19-22
• 1.5.1 研究目的及意义19-20
• 1.5.2 研究内容20-22
• 2 花粉管通道法转基因条件的优化22-30
• 2.1 实验材料与方法22-26
• 2.1.1 实验材料22-23
• 2.1.2 实验方法23-26
• 2.2 结果与分析26-28
• 2.2.1 转基因T0代种子的筛选26-27
• 2.2.2 授粉时间对基因转化效率的影响27-28
• 2.3 讨论28-30
• 3 转基因小麦T1代种子外源基因的检测和分析30-34
• 3.1 实验材料与方法30
• 3.1.1 实验材料30
• 3.1.2 实验方法30
• 3.2 结果与分析30-32
• 3.2.1 T0代阳性种子的补胚、移栽30-31
• 3.2.2 转基因T1代种子HMW-GS组成情况31-32
• 3.3 讨论32-34
• 4 转 1Dx5基因致小麦内源 1Dx2基因沉默因素的探究34-50
• 4.1 实验材料与方法34-39
• 4.1.1 实验材料34-35
• 4.1.2 实验方法35-39
• 4.2 结果与分析39-49
• 4.2.1 目的基因片段的克隆与测序39-41
• 4.2.2 VIGS重组载体的构建41-43
• 4.2.3 VIGS载体的线性化43-44
• 4.2.4 体外转录44-45
• 4.2.5 小麦穗部PDS基因沉默45-48
• 4.2.6 小麦穗部 1Dx2基因沉默48-49
• 4.3 讨论49-50
• 5 结论50-52
• 参考文献52-60
• 在读期间发表的论文60-61
• 致谢61

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 高瑞;使基因沉默[J];飞碟探索;2001年06期

2 肖友国;基因沉默[J];生物学教学;2002年12期

3 孟祥兵,贾寿华,王秀芳;基因沉默与生长发育[J];生命的化学;2002年02期

4 魏决;引起生物转基因沉默的因素、作用和对策[J];四川食品与发酵;2002年02期

5 房师松,邓平建,赵树进;基因沉默机制与预防对策[J];卫生研究;2004年04期

6 封福广;基因沉默及其生理学意义[J];衡水师专学报(综合版);2004年02期

7 彭燕;基因沉默发生和应用的研究进展[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2004年04期

8 陈雪梅,杜显刚,谭志巍,王亚琴,官鹏;基因沉默的研究进展[J];法律与医学杂志;2005年03期

9 韩婧;;基因沉默及克服策略[J];沧州师范专科学校学报;2006年04期

10 祝铁钢;武大勇;;基因沉默的生理意义及其应用[J];畜牧与饲料科学;2011年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 袁诚;李萃;马金;韩成贵;于嘉林;Andrew Jackson;李大伟;;大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默载体系统的改造及其应用[A];中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C];2009年

2 陈翔;;RNAi:从科学家的剪九到医师的治疗手段[A];中华医学会第十二次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2006年

3 施定基;张文俊;邓元告;冉亮;康瑞娟;赵兴贵;张越南;;藻类基因工程的一些进展[A];中国海洋生化学术会议论文荟萃集[C];2005年

4 王海光;李自超;;植物干旱胁迫应答基因及其产物研究进展[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年

5 陈爱葵;李梅红;;RNAi—基因沉默[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年

6 项晓琼;;RNAi技术在毒理学中的应用[A];中国药理学会毒理专业委员会第十次学术会议论文摘要汇编[C];2004年

7 刘家云;郝晓柯;李庆霞;马龙洋;温伟红;贾林涛;杨安钢;;靶向X区的siRNA抑制HBV基因的表达和复制[A];第九届西北五省（区）检验医学学术会议论文汇编[C];2005年

8 焦锋;楼程富;;基因在植物多倍体中的进化研究进展[A];中国蚕学会第三届青年学术研讨会暨浙江省第二届青年学术论坛——蚕桑分论坛论文集（上册）[C];2001年

9 吴丽娟;陈伟;康格非;蒋建新;朱佩芳;;锌指蛋白A20基因沉默载体研究与初步应用[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年

10 徐新云;毛侃琅;毛吉炎;;CYP3A4基因沉默和高表达对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响[A];中国毒理学会第六届全国毒理学大会论文摘要[C];2013年

中国重要报纸全文数据库 前9条

1 Esha Dey Pallavi Ail 编译 硕军;“基因沉默”先导者[N];医药经济报;2013年

2 南方日报记者 张胜波　林亚茗 通讯员 粤科宣;“广东是成果产业化好地方”[N];南方日报;2011年

3 记者 李荔;朱冰：环境也可以改变基因[N];北京科技报;2012年

4 记者 毛黎;科学家成功解开大量基因沉默之谜[N];科技日报;2008年

5 医学博士 科学松鼠会成员 致桦;美丽的干扰[N];中国经营报;2010年

6 纪光伟;2006,最出彩的是基因[N];健康报;2006年

7 张田勘;基因编辑器被寄予厚望[N];中国医药报;2014年

8 张田勘;垃圾DNA并非垃圾[N];文汇报;2012年

9 记者　许琦敏;基因“梁祝悲剧”诱发血癌[N];文汇报;2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 张兴坦;烟草MAPK基因的功能研究[D];重庆大学;2015年

2 Chabungbam Orville Singh（奥维尔）;家蚕BmPLA2和BmRab3基因的分子克隆、表达和功能研究[D];浙江大学;2014年

3 张彦苹;桃microRNA的识别及其与靶基因的作用模式分析[D];南京农业大学;2014年

4 张燕萍;青虾性别相关基因的筛选、克隆及时空表达分析[D];南京农业大学;2014年

5 穆春;棉花耐盐基因筛选及酪氨酸蛋白磷酸酶基因功能研究[D];中国农业大学;2016年

6 苏思远;组织蛋白酶D基因沉默诱导HeLa细胞老化的机制研究[D];中国科学院北京基因组研究所;2016年

7 张凌娣;同源序列高剂量异常表达及病毒编码蛋白对基因沉默的作用[D];中国农业大学;2004年

8 袁佐清;东亚三角涡虫DjPreb和DjStag基因表达与功能分析[D];中国海洋大学;2010年

9 邱庆明;若干生精细胞相关基因功能初步研究[D];中南大学;2009年

10 陈婷;果蝇中染色体乙酰化与去乙酰化修饰及其与热休克基因表达的关系[D];东北师范大学;2002年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 刘炎霖;水茄（Solanum torvum）StUBCc基因的克隆及功能初步分析[D];中国农业科学院;2015年

2 刘凯;棉花抗黄萎病相关基因GhSKIP35基因的克隆与功能验证[D];中国农业科学院;2015年

3 任梦飞;灵芝细胞悬浮培养中高表达灵芝鲨烯合酶基因提高灵芝酸单体的生产[D];昆明理工大学;2015年

4 梁甜;白桦OSC新基因的克隆、RNAi载体构建及遗传转化初步研究[D];东北林业大学;2015年

5 刘春娟;84K杨HDA903基因的克隆与功能分析[D];东北林业大学;2015年

6 胡亚平;Peroxiredoxin Ⅰ基因沉默对TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖及胶原合成影响的实验研究[D];河北联合大学;2014年

7 苏静芬;慢病毒介导恒河猴P53和P21基因沉默的初步研究[D];北京协和医学院;2015年

8 王素艳;残缘璃眼蜱subolesin和半胱氨酸蛋白酶基因生物学功能初步研究[D];中国农业科学院;2015年

9 向婷;渗透压胁迫下AM真菌Rhizophagus irregularis HOG1基因的功能研究[D];华中农业大学;2015年

10 宋雪;利用CRISPR/Cas9和TALENs技术敲除斑马鱼Vap、C1H7orf55、mri1、BX284640.3和dscr6基因[D];山东大学;2015年

，

本文编号：645973