稻瘟病抗病基因Pia与稻瘟病菌无毒基因AvrPia互作的分子机制研究

发布时间：2017-08-11 00:12

  本文关键词：稻瘟病抗病基因Pia与稻瘟病菌无毒基因AvrPia互作的分子机制研究

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【摘要】：水稻是最重要的粮食作物之一,养育了全球超过50%的人口。由丝状子囊真菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻瘟病是世界范围内最具破坏性的水稻病害之一。水稻-稻瘟病菌的互作关系符合经典的“基因对基因”学说,深入研究抗病基因和无毒基因间的关系既能更好地揭示宿主与病原菌间的互作机制,又能为抗病品种的选育提供新的策略。稻瘟病抗病基因Pia位于水稻11号染色体,本研究室在前期研究中对其进行了定位克隆,在阐述其分子进化过程的同时,也对其与相应无毒基因AvrPia的互作机制进行了研究分析。为进一步深入研究Pia与AvrPia的功能及互作模式,本研究主要开展了以下3个方面的工作,主要结果如下所示:1.Pia2_(CC)各截短蛋白的分子内互作预测Pia2_(CC(1-229))的二级结构并将其划分为7个截短蛋白。通过Y2H系统分析互作情况。结果显示,Pia2_(NtNN(1-140)),Pia2_(NtNN(1-176))及Pia2_(NtNN(1-229))都存在分子内互作,且Pia2_(NtNN(1-229))自身互作程度最弱。体外互作分析表明Pia2_(CC)形成同源复合物的最小功能单位是Pia2_(NtNN(1-140))。2.Pia1_(CC),Pia2_(CC)与AvrPia的体内互作前期研究证明Pia1_(CC),Pia2_(CC)与AvrPia具有体外互作。为进一步确定三者的体内互作情况,本研究进行了亚细胞定位、BiFC分析及Co-IP分析。亚细胞定位结果显示Pia2_(CC)具有线粒体定位、核质定位及混合定位的动态变化模式,且完整的蛋白结构是Pia2_(CC)存在线粒体定位所必需的条件。BiFC分析显示,Pia2_(CC)与Pia1_(CC)、AvrPia互作的主要场所为线粒体,Pia1_(CC)与AvrPia的互作场所为细胞核及细胞质。Co-IP实验也证实了AvrPia与Pia1_(CC)、Pia2_(CC)互作。3.Pia1_(FL),Pia2_(FL)与AvrPia三者的功能及互作为明确Pia与AvrPia的互作模式,本研究利用基于荧光素酶报告基因的水稻原生质体瞬时表达系统分析了三者的功能及互作关系。结果显示,R基因中只有融合NLS或NES标签的Pia2_(FL)会发生自激活现象;AvrPia全长蛋白及成熟蛋白均能够引起类HR的细胞凋亡反应。Pia1_(FL)能够抑制Pia2_(FL)-NLS或Pia2_(FL)-NES引起的自激活。同时,Co-IP分析也表明Pia1_(FL)与Pia2_(FL)互作。此外,LUC实验显示三基因共表达后能够触发一定程度的细胞凋亡反应,说明三基因组合存在互作。综合前期研究结果,本研究证明Pia1和Pia2都能够以直接的方式识别效应子AvrPia。Pia1和Pia2通过各自的CC结构域直接互作并形成复合体。当病原菌入侵时,Pia1的CtNL结构域蛋白能够识别AvrPia成熟蛋白,并通过Pia1与Pia2的互作把效应子信号传递给Pia2;同时,在AvrPia信号肽的诱导作用下,Pia2核质间的运输被打断,触发下游信号转导途径,激活免疫反应。
【关键词】：稻瘟病 Pia AvrPia 互作
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 1 前言11-17
• 1.1 植物抗病性的产生11
• 1.2 水稻稻瘟病抗病基因的研究概况11-13
• 1.2.1 稻瘟病抗病基因的研究意义11-12
• 1.2.2 稻瘟病抗病基因的研究进展12
• 1.2.3 抗病基因的结构、功能12-13
• 1.3 植物抗病蛋白亚细胞定位模式与功能的关系13-14
• 1.4 抗病基因与无毒基因互作的模式14-15
• 1.5 成对抗病基因与无毒基因的互作机制15-16
• 1.6 本研究的目的以及主要内容16-17
• 2 材料与方法17-22
• 2.1 实验材料17-18
• 2.1.1 菌物材料17
• 2.1.2 植物材料17
• 2.1.3 主要试剂17-18
• 2.1.4 主要仪器设备18
• 2.2 实验方法18-22
• 2.2.1 酵母双杂交（Y2H）实验18-19
• 2.2.2 亚细胞定位实验19-20
• 2.2.3 双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complemention, BiFC）实验20
• 2.2.4 利用水稻原生质体进行的免疫共沉淀实验20-21
• 2.2.5 基于荧光素酶报告基因的水稻原生质体瞬时表达实验21-22
• 3 结果与分析22-32
• 3.1 Pia2_(NtNN)截短蛋白的体外自身互作22-24
• 3.2 Pia1_(CC)与Pia2_(CC)的互作分析24-28
• 3.2.1 Pia1_(CC)及Pia2_(CC)的亚细胞定位24-27
• 3.2.2 Pia1_(CC)与Pia2_(CC)的体内互作27-28
• 3.3 Pia1_(CC)、Pia2_(CC)与AvrPia的体内互作28-30
• 3.3.1 Pia1_(CC)与AvrPia的BiFC互作分析28
• 3.3.2 Pia2_(CC)与AvrPia的BiFC互作分析28-30
• 3.4 Pia1、Pia2与AvrPia三者的Co-IP互作分析30
• 3.5 Pia1、Pia2与AvrPia三者的功能及互作分析30-32
• 4 结论与讨论32-36
• 4.1 蛋白功能表达与结构的关系32
• 4.2 抗病蛋白亚细胞定位与功能的关系32-33
• 4.3 Pia与AvrPia的互作模式33-35
• 4.4 本研究创新点35
• 4.5 下一步的研究设想35-36
• 致谢36-37
• 参考文献37-46
• 附录46
• 附录A：实验方法46-55
• 附录B：本研究所用引物总表55-59
• 附录C：研究期间构建载体列表59-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 温小红;谢明杰;姜健;杨宝灵;邵艳龙;何伟;刘丽;赵毅;;水稻稻瘟病防治方法研究进展[J];中国农学通报;2013年03期

2 ;Characterization and fine mapping of the rice blast resistance gene Pia[J];Science China(Life Sciences);2011年04期

3 刘金灵;刘雄伦;戴良英;王国梁;;植物抗病基因结构、功能及其进化机制研究进展(英文)[J];遗传学报;2007年09期

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本文编号：653329