茄科青枯菌致病力丧失相关基因的功能研究

发布时间：2017-08-15 13:14

  本文关键词：茄科青枯菌致病力丧失相关基因的功能研究

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【摘要】：茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)是世界上最重要的植物病原细菌之一,寄主范围广泛,可侵染50科450余种寄主植物。该病原菌在保存过程中易发生自然突变丧失致病力,但其机理还不清楚。本论文以分离自沙姜的茄科青枯菌自然致病力丧失突变体YC40-M作为研究对象,测定了突变体基因组全序列、筛选出突变基因、分析了5个致病相关候选基因功能,旨在揭示茄科青枯菌自然致病力丧失的分子机理,为青枯病防控技术研究提供理论依据。主要研究结果如下:1.以茄科青枯菌GMI1000基因组作为参考,对沙姜青枯菌株YC40的自然致病力丧失突变菌株YC40-M及其野生型YC40-W进行基因组重测序分析,SNP位点统计结果显示,YC40-M有45745个SNP位点,其中同义突变19443个,非同义突变18006个;YC40-W有45745位点,其中同义突变19689个,非同义突变18039个。InDel位点统计结果表明,YC40-M有1312个InDel位点,其中移码突变基因323个,非移码突变基因210个;而YC40-W有1291个InDel位点,其中移码突变基因314个,非移码突变基因208个。YC40-M与YC40-W差异位点1518个,非同义突变基因102个,包括碱基置换突变基因67个,移码突变基因35个。2.应用二代高通量Illumina Miseq和第三代PacBio测序技术,对YC40-M基因组全序列进行测定,其基因组全长为5.75Mb,包含5399个基因,4个rRNA操纵子,57个tRNA,其中染色体大小为3,844,764 bp(GenBank no.CP015850),编码3716个基因;宏质粒大小为1,907,366 bp(GenBank no.CP015851),编码1683个基因。染色体的基因中有3081个可以归属于COG家族,宏质粒基因中有770个可以归属于COG家族,还有224个基因在数据库中没有任何匹配。3.基因敲除构建YC40-W PhcA基因突变体YC40ΔPhcA。生物学测定显示,YC40ΔPhcA表型发生转换,生物膜增多,运动性增强,生长速率降低,生长增殖稳定期延长,对沙姜、番茄和辣椒的致病力较野生型菌株明显下降,验证了PhcA基因是参与青枯菌表型转换的关键基因。自然突变株YC40-M与YC40ΔPhc A相比,无致病力、无运动性、不引起烟草HR反应及在Boucher培养基中基本不生长。因此,Phc A参与青枯菌致病,而YC40-M与YC40ΔPhcA存在差异,说明青枯菌的自然致病力丧失除PhcA基因外还有其他基因参与。4.ParA2基因是细胞过程一种编码基因,ParA2基因敲除与功能分析表明,YC40-W ParA2基因突变体菌落明显变小,生长缓慢,胞外多糖分泌显著减少,无流动性,生物膜形成量减少,在NA培养基和Boucher基础培养基中生长速率均降低;突变体对沙姜的致病力明显降低。因此,ParA2基因对青枯菌的生长、胞外多糖分泌及其致病有重要作用。5.将YC40-W的RSp801、RSp931和RSc2202基因分别替换为YC40-M相应的突变基因片段,分别构建3个基因的突变体,其中RSp801基因突变体胞外多糖分泌增加,流动性增大,菌落直径变大,生物膜减少,在Boucher基础培养基中生长速率降低;RSp931基因突变体表型无明显变化,生物膜产量减少,在Boucher基础培养基中生长速率降低;RSc2202基因突变体胞外多糖分泌减少,流动性减弱,菌落直径变小,生物膜产量显著降低,在Boucher基础培养基中生长速率降低。接种寄主沙姜结果表明,RSc2202基因突变体接种处理的病株率比YC40-W低50%,说明其致病力下降;RSp801和RSp931基因突变体接种处理的病株率与YC40-W相同,但前者病情发展加快,后者病情减缓,说明前者致病力较野生型增强,而后者致病力下降。因此,RSp801、RSp931和RSc2202基因与青枯菌的致病力相关。
【关键词】：茄科青枯菌 自然致病力丧失 致病力相关基因 二代重测序 基因组测序 同源重组
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.42
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-15
• 1 前言15-33
• 1.1 茄科青枯菌分布及其危害15-16
• 1.1.1 茄科青枯菌分布15
• 1.1.2 茄科青枯菌危害15-16
• 1.2 茄科青枯菌特性16-21
• 1.2.1 茄科青枯菌侵染特性16-18
• 1.2.2 植物发病症状18
• 1.2.3 病原菌传统分类及演化型分类框架18-21
• 1.3 青枯菌致病相关因子21-26
• 1.3.1 Ⅲ型分泌系统及其效应子21-24
• 1.3.2 胞外多糖24
• 1.3.3 细胞壁降解酶(CWDE)相关基因24
• 1.3.4 运动性24-25
• 1.3.5 青枯菌解毒基因25-26
• 1.4 青枯菌群体感应下的表型转化26-30
• 1.4.1 群体感应机制26-27
• 1.4.2 青枯菌表型转化27-30
• 1.5 青枯菌基因组学30-32
• 1.5.1 青枯菌的基因组基本特征30
• 1.5.2 青枯菌全基因组30-32
• 1.5.3 基因水平转移与前噬菌体的作用32
• 1.6 沙姜青枯病菌32-33
• 1.7 本研究的目的及意义33
• 2 材料与方法33-52
• 2.1 实验材料33-38
• 2.1.1 菌株、质粒、引物及寄主植物33-35
• 2.1.2 试剂、培养基和缓冲液35-38
• 2.2 主要仪器38-39
• 2.3 青枯菌菌株YC40-W、YC40-M重测序分析39-40
• 2.4 青枯菌YC40-M基因组测序40-42
• 2.4.1 基因组DNA提取40
• 2.4.2 基因组序列测定及分析40-42
• 2.5 自杀质粒构建42-47
• 2.5.1 PhcA基因自杀质粒构建42-45
• 2.5.2 ParA2基因自杀质粒构建45
• 2.5.3 RSp801、RSp931、RSc2202基因自杀质粒构建45-47
• 2.6 青枯菌YC40感受态细胞的制备及电击转化47
• 2.7 突变体筛选及鉴定47-49
• 2.7.1 PhcA基因突变体筛选及鉴定47-48
• 2.7.2 ParA2基因突变体筛选及鉴定48
• 2.7.3 RSp801、RSp931、RSc2202基因突变菌株的筛选及鉴定48-49
• 2.8 基因功能互补菌株的筛选和鉴定49
• 2.8.1 PhcA基因功能互补菌株的的筛选和鉴定49
• 2.8.2 ParA2基因功能互补菌株的的筛选和鉴定49
• 2.8.3 RSp801、RSp931、RSc2202基因功能互补菌株的的筛选和鉴定49
• 2.9 基因的功能分析49-52
• 2.9.1 PhcA基因功能分析49-52
• 2.9.2 ParA2基因功能分析52
• 2.9.3 RSp801、RSp931、RSc2202基因功能分析52
• 3 结果与分析52-92
• 3.1 青枯菌YC40-W、YC40-M重测序结果52-54
• 3.2 青枯菌YC40-M基因组测序结果54-61
• 3.2.1 原始测序数据质控54-55
• 3.2.2 测序数据统计55-56
• 3.2.3 基因组组装56
• 3.2.4 基因预测结果56-57
• 3.2.5 基因注释57-60
• 3.2.6 基因组特征60-61
• 3.3 PhcA基因功能分析61-72
• 3.3.1 青枯菌YC40 PhcA突变体的构建和验证61-63
• 3.3.2 YC40ΔPhcA菌株表型特征63-64
• 3.3.3 YC40 PhcA基因缺失突变体功能互补64-65
• 3.3.4 YC40ΔPhcA与YC40-M生物学测定65-69
• 3.3.5 YC40ΔPhcA、YC40-M致病性测定结果69
• 3.3.6 YC40ΔPhcA及YC40-W菌株寄主范围测定结果69-72
• 3.4 Par A2基因功能分析72-77
• 3.4.1 青枯菌YC40菌株ParA2突变体的构建结果72
• 3.4.2 YC40 ParA2基因缺失突变体功能互补72-73
• 3.4.3 ParA2突变体生物学试验结果73-76
• 3.4.4 突变体对沙姜的致病性分析结果76-77
• 3.5 基因RSp801、RSp931和RSc2202的功能分析77-92
• 3.5.1 基因生物信息学分析结果77-78
• 3.5.2 RSp801、RSp931、RSc2202基因自杀质粒和突变菌株筛选验证78-79
• 3.5.3 3个基因突变体功能互补79
• 3.5.4 YC40Δ801 突变体生物学特性79-82
• 3.5.5 YC40Δ801 突变体对沙姜的致病性分析82-83
• 3.5.6 YC40Δ931 突变体生物学特性83-86
• 3.5.7 YC40Δ931 突变体对沙姜的致病性分析86-87
• 3.5.8 YC40Δ2202 突变体生物学特性87-90
• 3.5.9 YC40Δ2202 突变体对沙姜的致病性分析90-92
• 4 结论与讨论92-99
• 4.1 重测序分析青枯菌YC40自然致病力丧失突变体及其野生型全基因组92-93
• 4.2 青枯菌YC40自然致病力丧失突变体基因组序列特征93-95
• 4.3 青枯菌Phc A基因的功能95-97
• 4.4 YC40菌株自然致病力丧失突变体与PhcA基因缺失突变体的差异97
• 4.5 YC40菌株Par A2基因的功能97-98
• 4.6 YC40菌株RSp801、RSp931和RSc2202基因的功能98-99
• 4.7 5个基因的互补试验99
• 5 总结论与未来研究建议99-101
• 5.1 总结论99-100
• 5.2 未来研究建议100-101
• 致谢101-103
• 参考文献103-113

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：678359