基于木质纤维素生物炼制废物的微生物油脂生产及其机理研究

发布时间：2018-03-29 16:22

本文选题：木质纤维素　切入点：微生物油脂　出处：《湖南大学》2015年博士论文

【摘要】：化石资源的大量消耗以及随之而来的环境污染问题使得研究新的可再生清洁能源成为当务之急。生物柴油被认为是优质的石化燃料替代品。目前普遍使用的生物柴油原料,如植物油脂和餐饮废弃油脂等,已难以满足日益扩大的生物柴油市场需求。微生物油脂以其独特的优势(例如生产周期较短,不受限于地理环境和季节)被逐渐应用于能源领域,成为生物柴油生产的发展趋势之一。而寻找廉价的碳源培养基以降低其生产成本是大规模生产与应用微生物油脂的关键。木质纤维素原料在生物炼制过程中可产生多种含碳废物。鉴于产油微生物对碳源利用的广谱性,本文采用浑浊红球菌(Rhodococcus opacus)PD630及DSM 1069作为产油功能菌,考察了热解轻油、生物乙醇生产预处理废液,以及制浆造纸黑液碱木质素等木质纤维素生物炼制废物作为潜在的油脂生产原料的可行性,并通过凝胶渗透色谱(GPC)、核磁共振(NMR)、扫描电子显微镜(SEM)等检测手段初步探讨了其中的作用机理,旨在为微生物油脂应用于生物柴油提供新的碳源途径,同时为推动木质纤维素废物的资源化利用提供理论依据和技术支持。本文具体的研究工作和主要成果归纳如下。首先,论文探索这两种菌在热解轻油培养基中的生长及油脂积累情况。实验中设置了两组不同的p H值。研究证明细菌在酸性(p H=4)及中性(p H=7)条件下均可进行细胞增殖,且在一定范围内细菌生物量随着底物浓度的升高而增大。扩大实验数据表明,将适应后的菌体转移至氮源缺乏的轻油培养基后均生长良好。其中酸性条件下菌体增殖更快,PD630和DSM 1069的最大生物量分别可达到0.82及0.90g/L,相比于p H=7的基质分别增长了10.81和9.76%,且两种细菌的油脂含量最大值均出现在16 h,分别占细菌干重的25.8和22.0%。另外酸性条件下DSM 1069的脂肪酸主要为饱和脂肪酸,随着外界环境p H值增大到7,胞内饱和脂肪酸合成减少,不饱和脂肪酸含量增加。而PD630在两种p H值条件下均大量积累饱和脂肪酸,尤其在p H值为7时,饱和脂肪酸的比例远远大于不饱和脂肪酸。31P NMR及13C NMR分析表明发酵过程中,细菌主要攻击脂肪链类物质,同时芳香族化合物单体及二聚体也发生相应减少。不同木质纤维素生物质预处理废液中也含有糖类及木质素衍生物等多种有机物。本实验以热水预处理及有机溶剂预处理废液为研究对象,预实验首先分别考察了PD630及DSM 1069在葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖五种单糖不同浓度溶液下的生长情况,发现细菌主要利用六碳糖进行细胞代谢,且菌体增长随着单糖浓度的增大而增大。其中PD630可利用葡萄糖、甘露糖和半乳糖,而DSM 1069只能消耗前两种糖类。热水预处理废液直接作为培养基质时造成细菌大量死亡,表明预处理过程生成的HMF、呋喃甲醛等副产物严重抑制了细菌的生理活动。石灰法联合非离子型树脂吸附法可有效去除废液中的副产物。去毒后,火炬松预处理废液(DPAH)中R.opacus PD630和DSM 1069细菌生物量均在72 h达到最大,分别为0.96 g/L、1.03 g/L,而枫香树预处理废液(DSAH)中细菌的生长延滞期较长,其达到的最大生物量分别为1.18 g/L(PD630)及1.06 g/L(DSM 1069)。另外,DSAH培养基中PD630菌体含油量最大可达到28.6%,油脂产量为0.25 g/L。而DSM 1069可在DPAH为碳源时达到产油水平,其最大油脂含量及油脂产量分别为为28.3%、0.31 g/L。有机溶剂预处理废液中除了溶出的半纤维素衍生糖类之外,还含有木质素降解的芳香环衍生物。实验结果表明,R.opacus DSM 1069可同时利用乙醇预处理废液中的糖类(主要为葡萄糖)和芳香环化合物,并将其转化为菌体油脂。其最大油脂含量出现在48 h,油脂含量为26.88%。发酵前及48 h的油脂成分主要为偶数碳链的脂肪酸,包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)及油酸(C18:1)。接着,本研究考察了R.opacus DSM 1069对黑液提取碱木质素(BL-Kraft lignin)及商业碱木质素的降解。研究发现,以BL-Kraft lignin为碳源时,所得菌体最大油脂含量仅为6%。GPC、13C NMR及HSQC-NMR等分析手段表明细菌主要利用碱木质素中高含量的小分子抽提物进行细胞增殖。为提高油脂产量及木质素转化率,实验进一步引入氧降解处理方法对碱木质素进行预处理(O2-Kraft lignin)。以商用碱木质素(其木质素含量为88.11%,抽提物及糖类含量极少)为研究对象。结果表明,未处理的碱木质素(Untreated-Kraft lignin)和氧降解处理强度不足的碱木质素(O2-Kraft lignin-A)均难以维持细菌生长。当增加预处理强度(预处理B)时,碱木质素大分子结构断裂,分子量明显减小。细菌在O2-Kraft lignin-B培养基中增殖显著,发酵后菌落数比发酵前增加了~460倍。36 h时测得最大油脂含量为14.21%,油脂产量为0.067 mg/m L,碱木质素转化率为28%。其中油脂脂肪酸组成主要为棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)。结合GPC、31P NMR、HSQC-NMR结果可以推测,细菌可分泌酶液将木质素碎片降解为单体或者二聚体,并进一步将其转化为原儿茶酸等β-酮己二酸代谢途径前体。木质素较小分子量部分被细菌利用,而难降解的大分子物质被残留下来。本文研究了多种木质纤维素生物炼制废物作为微生物油脂生产原料的可能性,为发展廉价碳源从而实现微生物油脂生产经济性提供了一条新的途径,对进一步降低生物柴油成本,推动了生物柴油的广泛应用具有重要意义。
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【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TE667

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