莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶cDNA克隆及其油脂调控的研究

发布时间：2019-07-23 20:13

【摘要】：微藻生物柴油因环保、可再生、原料生长周期短等优点成为研究的热点。但天然微藻油脂含量低,且油脂提取成本高,严重影响了微藻生物柴油产业化的进程。利用基因工程手段调控油脂合成与代谢相关基因,对于提高微藻油脂含量、实现其脂肪酸分泌具有重要意义。酰基辅酶A合成酶(ACS)能活化生物体内的自由脂肪酸,进而广泛参与油脂的合成与代谢反应。本研究从莱茵衣藻基因组数据库中预测出两个ACS基因,通过RT-PCR克隆其c DNA,并对其编码蛋白进行序列分析与功能预测。采用酵母互补实验研究其体外功能,确认其具有ACS活性。进一步构建了反义ACS基因的工程藻株,结合荧光定量PCR和GC-MS检测,最终证实莱茵衣藻ACS参与了油脂代谢且促进了脂肪酸分泌。具体结果如下:利用生物信息学方法从莱茵衣藻基因组中预测出两个ACS基因,首次克隆其c DNA,分别命名为cracs1和cracs2,其长度分别为2 004 bp和2 016 bp。对其编码蛋白cr ACS1和cr ACS2分析发现,二者均包含ACS的两个保守区域:AMP-binding区和FACS标签。进化树比对显示cr ACS1和cr ACS2与拟南芥的长链ACSs具有较高的同源性,均为长链ACS。莱茵衣藻ACS在酵母YB525中表达检测发现,cr ACS1和cr ACS2均能互补酵母YB525的ACS缺陷表型,可活化并利用外源脂肪酸。cr ACS1和cr ACS2均偏好活化长链脂肪酸,其中cr ACS1偏好C16:1和C18:1,cr ACS2偏好C16:0、C18:0、C16:1和C18:1。该结果表明cr ACS1和cr ACS2具有ACS活性,属于酰基辅酶A合成酶家族。获得了反义cracs1、cracs2基因的工程藻株q-15、p-13。荧光定量结果发现,q-15的cracs1表达量与cc849相比下降53.78%;p-13的cracs2表达量与cc849相比下降23.67%。此外,研究发现cracs1与cracs2的m RNA表达量之间存在关联性,p-13中反义cracs2片段可促进cracs1的表达;而q-15中反义cracs1片段可导致cracs2表达量的下降。工程藻株q-15和p-13的脂肪酸分析结果显示,细胞内总脂含量均明显上升,同时都表现出明显脂肪酸分泌现象。q-15和p-13的胞内总脂含量分别为130.1μg/mg、141.6μg/mg,与cc849相比分别上升45%和55%;q-15和p-13分泌的脂肪酸含量分别为13.413mg/109cells和16.89 mg/109cells。综上所述,本研究首次克隆并探究了莱茵衣藻ACS的功能,成功利用其调控莱茵衣藻脂肪酸代谢。证明莱茵衣藻ACS不仅促进胞内脂肪酸的累积,且实现了脂肪酸的分泌。本研究不仅为ACS调控莱茵衣藻的油脂合成与代谢研究打下一定基础,也为微藻生物柴油的发展提供一定的理论依据。
【图文】：

生物柴油生产的简易流程图

ACS参与的代谢途径[53]

图 2 ACS 参与的代谢途径[53]源脂肪酸的摄入 ②膜脂的流通 ③脂肪酸的从头合成 ④三脂酰甘油和固醇的水解 ⑤脂类的合成OLE1 的抑制 ②诱导过氧化物酶基因表达 C：①参与囊泡运输和细胞器合成 ②信号转导与配在生物体内发挥着重要的作用，参与多种代谢途径（图 2）。例如：脂肪、细胞信号转导、细胞壁的合成、脂肪酸合成磷脂或三脂酰甘油，脂肪酸去饱和，蛋白的脂酰化，脂肪酸的降解包括α-、β-、w-氧化降解等这些过程[辅酶 A 合成酶调控脂肪酸的研究基辅酶 A 合成酶调控脂肪酸合成与代谢的研究广泛存在于各种生物，在脂肪酸的代谢途径中具有重要作用。目前一些高、真菌和微藻的长链 ACS（LACS）家族基因已经被克隆和分析[54-59]。高物拟南芥含有 9 个 LACS 基因，其中 7 个能够互补缺陷 ACS 的酵母表型和遗传学研究表明，，其 LACS 活性与质体脂肪酸的合成[51]、活化[60]、角质肪酸的β-氧化[52]等有密切关系[62]。其中有关脂肪酸的合成与代谢方面的研
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q946.5;TE667

【参考文献】