疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化活性的分子改造
发布时间：2022-01-06 16:36
疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosus lipase,TLL）由于具有热稳定性好、催化活性高、耐碱性等特点,在生物柴油、洗涤剂、食品、化妆品、皮革、医药和环境等领域作为工业催化剂应用广泛。然而,工业生产对脂肪酶的活性和耐受性有着极其严苛的要求,对TLL进行性质的优化能够克服其应用瓶颈,降低其生产成本。为了提高TLL的催化活性等性质,本研究利用计算机辅助设计和点饱和突变技术以及定点突变技术对TLL的催化活性及稳定性进行分子改造,产生的TLL突变体被证明具有良好的催化活性并且能够很好的应用到生物柴油工艺中。1.我们利用半理性设计,通过点饱和突变技术对TLL进行分子改造。选取TLL上的三个氨基酸位点（G23,D62,D96）进行三点饱和突变,完成了5760个突变体的筛选,得到12个酶活提高的的突变体。（1）通过分析突变体的性质,我们发现TLL的第96位氨基酸与其催化活性和酶学性质关系紧密,且G23,D62,D96这三个位点的复合突变可以获得酶学性质更加丰富的突变体。（2）且突变体G23A/D62K/D96H、D62R/D96E、D96Q、D96M、D96K、D...
【文章来源】：云南师范大学云南省
【文章页数】：109 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
脂肪酶催化甘油三酯水解示意图
第1章绪论3解酶，它的二级结构仅包含6条β折叠片和5条α螺旋[19]。脂肪酶是一类丝氨酸水解酶，其催化三联体结构与丝氨酸蛋白酶家族类似，活性中心都由一个亲核残基丝氨酸，一个酸性氨基酸天冬氨酸或谷氨酸和一个碱性氨基酸组氨酸构成（Ser-Asp/Glu-His）[18]。在脂肪酶的二级结构中，催化三联体的Ser位于β5折叠片之后、α螺旋之前，形成的β转角-α螺旋结构称之为亲核肘（Nucleophileelbow），Asp/Glu位于β7折叠片后，His一般位于最后一个β折叠片之后[20]。不同脂肪酶的二级结构在α/β水解酶基础结构上有所不同，通过不同数量的α螺旋和β折叠、不同分布的α螺旋以及不同弯曲程度的β折叠构成不同的二级结构，从而使不同微生物脂肪酶具有不同的底物结合位点，表现出不同催化特性。图1.2典型的α/β水解酶折叠结构示意图Figure1.2Schematicstructureofα/βhydrolasefold丝氨酸蛋白酶家族的催化三联体位于其分子表面，而大多数脂肪酶的催化三联体却隐藏在一段α螺旋结构之下，这个结构被称为脂肪酶的“盖子”（Lid）[21]。这个特殊的盖子结构是由一段具有双亲性的α螺旋结构组成，即α螺旋两侧分别由亲水性氨基酸和疏水性氨基酸组成，并且亲水一侧面向朝外，疏水一侧面向活性中心进行保护。盖子结构很好的解释了脂肪酶的催化机制。
TLL脂肪酶盖子开放和关闭的结构示意[26]
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于蛋白质折叠自由能分析的定点突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性[J]. 童理明,刘松,李江华,堵国城,陈坚. 食品与生物技术学报. 2018(12)
[2]定点突变引入二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性的研究[J]. 姜占宝,韩楠玉,苗华彪,黄遵锡. 工业微生物. 2018(05)
[3]脂肪酶TLL在毕赤酵母中表达及催化制备生物柴油初探[J]. 尤逊,杨江科,陈祺琛,彭小波,陈光军. 生物技术. 2018(03)
[4]基于磁性纳米载体的固定化脂肪酶在生物柴油中的应用研究进展[J]. 张玮玮,杨慧霞. 石油化工应用. 2017(12)
[5]微生物脂肪酶的性质及应用研究[J]. 杨媛,张剑. 中国洗涤用品工业. 2017(04)
[6]甲酯化方法对甘油三酯和游离型脂肪酸混合物脂肪酸分析的影响[J]. 张白曦,宋宇航,杨芹,张灏,陈卫. 中国粮油学报. 2016(09)
[7]生物柴油的研究及应用进展[J]. 张文毓. 化学与黏合. 2016(02)
[8]各类微生物脂肪酶酶学性质及应用的研究进展[J]. 黄璜,李宗军,王远亮,侯爱香. 粮油食品科技. 2014(01)
[9]易错PCR提高华根霉脂肪酶的热稳定性[J]. 王睿,喻晓蔚,徐岩. 生物工程学报. 2013(12)
[10]脂肪酶产生菌的筛选·产酶条件及酶特性研究[J]. 薛静,陶树兴,田泽英,苏蕊,丛寅. 安徽农业科学. 2011(15)
硕士论文
[1]通过定点突变提高伯克霍尔德菌脂肪酶的热稳定性的研究[D]. 董盼盼.福建师范大学 2018
[2]热泉菌Bacillus sp.BI-19产耐高温脂肪酶的基因克隆及其酶学性质研究[D]. 刘秀萌.山东大学 2016
[3]A. niger Li-38产脂肪酶及其催化棉籽油合成生物柴油的研究[D]. 唐凤仙.石河子大学 2008
[4]Geotrichum sp. SYBC WU-3产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究[D]. 王蕾.江南大学 2008
本文编号：3572801
【文章来源】：云南师范大学云南省
【文章页数】：109 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
脂肪酶催化甘油三酯水解示意图
第1章绪论3解酶，它的二级结构仅包含6条β折叠片和5条α螺旋[19]。脂肪酶是一类丝氨酸水解酶，其催化三联体结构与丝氨酸蛋白酶家族类似，活性中心都由一个亲核残基丝氨酸，一个酸性氨基酸天冬氨酸或谷氨酸和一个碱性氨基酸组氨酸构成（Ser-Asp/Glu-His）[18]。在脂肪酶的二级结构中，催化三联体的Ser位于β5折叠片之后、α螺旋之前，形成的β转角-α螺旋结构称之为亲核肘（Nucleophileelbow），Asp/Glu位于β7折叠片后，His一般位于最后一个β折叠片之后[20]。不同脂肪酶的二级结构在α/β水解酶基础结构上有所不同，通过不同数量的α螺旋和β折叠、不同分布的α螺旋以及不同弯曲程度的β折叠构成不同的二级结构，从而使不同微生物脂肪酶具有不同的底物结合位点，表现出不同催化特性。图1.2典型的α/β水解酶折叠结构示意图Figure1.2Schematicstructureofα/βhydrolasefold丝氨酸蛋白酶家族的催化三联体位于其分子表面，而大多数脂肪酶的催化三联体却隐藏在一段α螺旋结构之下，这个结构被称为脂肪酶的“盖子”（Lid）[21]。这个特殊的盖子结构是由一段具有双亲性的α螺旋结构组成，即α螺旋两侧分别由亲水性氨基酸和疏水性氨基酸组成，并且亲水一侧面向朝外，疏水一侧面向活性中心进行保护。盖子结构很好的解释了脂肪酶的催化机制。
TLL脂肪酶盖子开放和关闭的结构示意[26]
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于蛋白质折叠自由能分析的定点突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性[J]. 童理明,刘松,李江华,堵国城,陈坚. 食品与生物技术学报. 2018(12)
[2]定点突变引入二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性的研究[J]. 姜占宝,韩楠玉,苗华彪,黄遵锡. 工业微生物. 2018(05)
[3]脂肪酶TLL在毕赤酵母中表达及催化制备生物柴油初探[J]. 尤逊,杨江科,陈祺琛,彭小波,陈光军. 生物技术. 2018(03)
[4]基于磁性纳米载体的固定化脂肪酶在生物柴油中的应用研究进展[J]. 张玮玮,杨慧霞. 石油化工应用. 2017(12)
[5]微生物脂肪酶的性质及应用研究[J]. 杨媛,张剑. 中国洗涤用品工业. 2017(04)
[6]甲酯化方法对甘油三酯和游离型脂肪酸混合物脂肪酸分析的影响[J]. 张白曦,宋宇航,杨芹,张灏,陈卫. 中国粮油学报. 2016(09)
[7]生物柴油的研究及应用进展[J]. 张文毓. 化学与黏合. 2016(02)
[8]各类微生物脂肪酶酶学性质及应用的研究进展[J]. 黄璜,李宗军,王远亮,侯爱香. 粮油食品科技. 2014(01)
[9]易错PCR提高华根霉脂肪酶的热稳定性[J]. 王睿,喻晓蔚,徐岩. 生物工程学报. 2013(12)
[10]脂肪酶产生菌的筛选·产酶条件及酶特性研究[J]. 薛静,陶树兴,田泽英,苏蕊,丛寅. 安徽农业科学. 2011(15)
硕士论文
[1]通过定点突变提高伯克霍尔德菌脂肪酶的热稳定性的研究[D]. 董盼盼.福建师范大学 2018
[2]热泉菌Bacillus sp.BI-19产耐高温脂肪酶的基因克隆及其酶学性质研究[D]. 刘秀萌.山东大学 2016
[3]A. niger Li-38产脂肪酶及其催化棉籽油合成生物柴油的研究[D]. 唐凤仙.石河子大学 2008
[4]Geotrichum sp. SYBC WU-3产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究[D]. 王蕾.江南大学 2008
本文编号：3572801
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