不同酰基-酰基载体蛋白突变体的合成及其反应活性研究
发布时间：2022-07-14 14:00
生物途径合成的甘油三酯（TAG）是重要的生物能源前体。酰基-酰基载体蛋白（acyl-ACP）作为其合成途径中的重要底物,与甘油三磷酸（G-3-P）在甘油三磷酸酰基转移酶（GPAT）的催化下生成的溶血磷脂酸（LPA）是TAG合成路径中第一个反应,对于TAG的合成起着重要的调控作用。因此对于acyl-ACP与GPAT的反应研究具有重要意义。在ACP作为acyl-ACP底物的部分参与到GPAT催化酰基转移反应时,通常仅视为酰基链为GPAT的催化选择性,而忽略了ACP在其中的贡献,这种选择机制的误解存在于很多催化ACP反应的酶中。因此为了能够研究acyl-ACP的ACP部分对GPAT的选择性贡献,获得不同链长acyl-ACP及其突变体,并对其与GPAT的反应活性进行分析研究是深入了解ACP的结构和功能,并认识ACP参与酶反应动力学分子机制的重要前提。本研究根据野生型ACP的氨基酸序列及三维结构信息,设计了涉及11个氨基酸位点共12株ACP突变体。体外构建12株ACP突变体的表达质粒并在大肠杆菌中可溶表达。在acyl-ACP合成酶的作用下将结合了4’-磷酸泛酰巯基乙胺基团（4’-PPT）的活性A...
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 微藻与生物柴油
1.1.1 微藻的介绍
1.1.2 生物柴油的概念
1.1.3 微藻生物柴油的独特优势
1.1.4 微藻生物柴油的机遇
1.2 甘油三酯的合成
1.2.1 脂肪酸合成途径
1.2.2 TAG合成途径
1.3 酰基载体蛋白概述
1.3.1 酰基载体蛋白的研究概况
1.3.2 ACP的结构研究
1.4 酰基载体蛋白的工业应用
1.5 甘油-3-磷酸酰基转移酶的概述
1.6 acyl-ACP与 GPAT相互作用研究进展
1.7 本论文的研究内容和研究思路
1.8 本论文立题目的和意义
2 不同acyl-ACP突变体的制备
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要仪器
2.2.2 主要实验材料
2.2.3 培养基
2.2.4 主要溶液
2.3 实验方法
2.3.1 感受态细胞的制备
2.3.2 热激法转化质粒
2.3.3 ACP突变体的设计及构建
2.3.4 holo-ACP不同突变体的诱导表达
2.3.5 holo-ACP的纯化
2.3.6 acyl-ACP合成酶AasS的表达纯化
2.3.7 不同链长acyl-ACP及其突变体的合成
2.3.8 SDS-PAGE检测重组蛋白表达纯化
2.3.9 Bradford法测定蛋白浓度
2.3.10 HPLC定量检测holo-ACP、acyl-ACP含量
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 holo-ACP突变体表达纯化性质差异
2.4.2 HPLC检测分析acyl-ACP性质差异
2.4.3 acyl-ACP的稳定性差异
2.5 小结
3 不同链长acyl-ACP及其突变体与GPAT的酶活测定
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要仪器
3.2.2 实验试剂
3.2.3 主要溶液
3.3 实验方法
3.3.1 LiGPAT的诱导表达
3.3.2 LiGPAT纯化
3.3.3 acyl-ACP与 Li GPAT的酶活测定
3.3.4 HPLC检测GPAT与 acyl-ACP的活性
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 16 :0-ACP突变体酶活测定反应特性比较
3.4.2 18 :1-ACP突变体酶活测定反应特性比较
3.4.3 LiGAPT对酰基链长的选择性
3.5 小结
结论与展望
参考文献
附录A 缩略语表及名称说明
附录B E.coli-ACP序列
附录C ACP质粒图
附录D Holo-ACP凝胶过滤色谱图
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]微藻规模化培养技术研究进展[J]. 吕旭,孙仁旺,张红兵. 应用化工. 2019(06)
[2]白念珠菌酰基载体蛋白1的制备[J]. 孟玲宁,刘锦燕,王钰婷,项明洁. 诊断学理论与实践. 2018(06)
[3]浅谈微藻生物柴油[J]. 刘婷. 生物化工. 2018(04)
[4]能源微藻的应用[J]. 宋瑞雪. 生物化工. 2018(04)
[5]微藻制备生物柴油技术综述[J]. 张萌,贾文川. 当代化工. 2018(04)
[6]Acyl-ACPs的规模化合成[J]. 丁威,冯延宾,曹旭鹏,薛松. 中国生物工程杂志. 2018(04)
[7]酰基载体蛋白在不同代谢通路中的作用[J]. 陶永佳,薛永常. 生命的化学. 2016(06)
[8]植物酰基载体蛋白基因家族序列分析[J]. 李孟军,史占良,郭进考,何明琦,王彦霞. 华北农学报. 2010(S1)
[9]Substrate Selectivity of Glycerol-3-phosphate Acyl Transferase in Rice[J]. Su-Qin Zhu,Hua Zhao,Rong Zhou,Ben-Hua Ji and Xiao-Yan Dan (School of Life Sciences,Nantong University,Nantong 226007,China). Journal of Integrative Plant Biology. 2009(11)
[10]麻疯树酰基载体蛋白的基因克隆、表达分析及原核表达[J]. 江璐玎,王云霄,王迎春,张颖,秦小波,徐莺,陈放. 应用与环境生物学报. 2008(06)
博士论文
[1]三角褐指藻甘油三酯合成及累积途径相关重要节点的研究[D]. 汪翔.暨南大学 2018
硕士论文
[1]海洋产油微生物筛选及酰基载体蛋白基因克隆[D]. 陶永佳.大连工业大学 2017
[2]花生酰基载体蛋白基因的克隆与功能分析[D]. 魏丽奇.山东师范大学 2009
本文编号：3661261
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 微藻与生物柴油
1.1.1 微藻的介绍
1.1.2 生物柴油的概念
1.1.3 微藻生物柴油的独特优势
1.1.4 微藻生物柴油的机遇
1.2 甘油三酯的合成
1.2.1 脂肪酸合成途径
1.2.2 TAG合成途径
1.3 酰基载体蛋白概述
1.3.1 酰基载体蛋白的研究概况
1.3.2 ACP的结构研究
1.4 酰基载体蛋白的工业应用
1.5 甘油-3-磷酸酰基转移酶的概述
1.6 acyl-ACP与 GPAT相互作用研究进展
1.7 本论文的研究内容和研究思路
1.8 本论文立题目的和意义
2 不同acyl-ACP突变体的制备
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要仪器
2.2.2 主要实验材料
2.2.3 培养基
2.2.4 主要溶液
2.3 实验方法
2.3.1 感受态细胞的制备
2.3.2 热激法转化质粒
2.3.3 ACP突变体的设计及构建
2.3.4 holo-ACP不同突变体的诱导表达
2.3.5 holo-ACP的纯化
2.3.6 acyl-ACP合成酶AasS的表达纯化
2.3.7 不同链长acyl-ACP及其突变体的合成
2.3.8 SDS-PAGE检测重组蛋白表达纯化
2.3.9 Bradford法测定蛋白浓度
2.3.10 HPLC定量检测holo-ACP、acyl-ACP含量
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 holo-ACP突变体表达纯化性质差异
2.4.2 HPLC检测分析acyl-ACP性质差异
2.4.3 acyl-ACP的稳定性差异
2.5 小结
3 不同链长acyl-ACP及其突变体与GPAT的酶活测定
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要仪器
3.2.2 实验试剂
3.2.3 主要溶液
3.3 实验方法
3.3.1 LiGPAT的诱导表达
3.3.2 LiGPAT纯化
3.3.3 acyl-ACP与 Li GPAT的酶活测定
3.3.4 HPLC检测GPAT与 acyl-ACP的活性
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 16 :0-ACP突变体酶活测定反应特性比较
3.4.2 18 :1-ACP突变体酶活测定反应特性比较
3.4.3 LiGAPT对酰基链长的选择性
3.5 小结
结论与展望
参考文献
附录A 缩略语表及名称说明
附录B E.coli-ACP序列
附录C ACP质粒图
附录D Holo-ACP凝胶过滤色谱图
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]微藻规模化培养技术研究进展[J]. 吕旭,孙仁旺,张红兵. 应用化工. 2019(06)
[2]白念珠菌酰基载体蛋白1的制备[J]. 孟玲宁,刘锦燕,王钰婷,项明洁. 诊断学理论与实践. 2018(06)
[3]浅谈微藻生物柴油[J]. 刘婷. 生物化工. 2018(04)
[4]能源微藻的应用[J]. 宋瑞雪. 生物化工. 2018(04)
[5]微藻制备生物柴油技术综述[J]. 张萌,贾文川. 当代化工. 2018(04)
[6]Acyl-ACPs的规模化合成[J]. 丁威,冯延宾,曹旭鹏,薛松. 中国生物工程杂志. 2018(04)
[7]酰基载体蛋白在不同代谢通路中的作用[J]. 陶永佳,薛永常. 生命的化学. 2016(06)
[8]植物酰基载体蛋白基因家族序列分析[J]. 李孟军,史占良,郭进考,何明琦,王彦霞. 华北农学报. 2010(S1)
[9]Substrate Selectivity of Glycerol-3-phosphate Acyl Transferase in Rice[J]. Su-Qin Zhu,Hua Zhao,Rong Zhou,Ben-Hua Ji and Xiao-Yan Dan (School of Life Sciences,Nantong University,Nantong 226007,China). Journal of Integrative Plant Biology. 2009(11)
[10]麻疯树酰基载体蛋白的基因克隆、表达分析及原核表达[J]. 江璐玎,王云霄,王迎春,张颖,秦小波,徐莺,陈放. 应用与环境生物学报. 2008(06)
博士论文
[1]三角褐指藻甘油三酯合成及累积途径相关重要节点的研究[D]. 汪翔.暨南大学 2018
硕士论文
[1]海洋产油微生物筛选及酰基载体蛋白基因克隆[D]. 陶永佳.大连工业大学 2017
[2]花生酰基载体蛋白基因的克隆与功能分析[D]. 魏丽奇.山东师范大学 2009
本文编号：3661261
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/shiyounenyuanlunwen/3661261.html
