多肽抗菌表面的构建及其稳定性改进研究
发布时间：2020-05-13 22:11
【摘要】：植入性医疗器械在现代临床中应用非常广泛,但在应用过程中普遍存在细菌感染的问题。表面改性是有效提高植入器械的抗菌性能的方法之一。抗菌多肽是一种具有抗菌活性的小分子肽类化合物,一般由9-50个氨基酸组成,带有正电荷并含有多数疏水性氨基酸残基而呈现疏水性,具有广谱高效抗菌性和不易产生耐药性等特点。但部分抗菌多肽在体内应用时存在有效性和酶解稳定性问题,本课题针对这两个问题利用可控的原子转移自由基聚合(ATRP)和点击化学(click chemestry)将聚磺基甜菜碱(polySBMA)以及抗菌多肽接枝到表面,提高抗菌多肽的在表面应用的有效性和稳定性。对多肽的N端进行修饰是提高抗菌多肽有效性的方法之一。本课题选用HHC36作用研究对象,对HHC36的N端进行修饰,引入L-炔丙基甘氨酸,在引入点击反应官能团--炔基的同时,提高其盐溶液中的耐盐性。结果显示修饰前的抗菌多肽HHC36(AMP)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC100均分别为6μM和8μM,而Pra HHC36(PraAMP)则相应提高2μM,但生物活性稳定更高,在PBS溶液里仍然能保持较好的抗菌性能。两种多肽即使在0.5 MIC下仍然能显著影响细菌的生长,但对小鼠间充质干细胞表现出一定的细胞毒性。利用SI-ATRP技术在Si表面引入聚磺酸基甜菜碱,再通过一价铜离子催化的CUAAC点击反应将抗菌多肽固定到表面上,解决传统接枝方法使多肽失活的问题,并研究多肽在表面的盐稳定性和抗酶解能力。Biotin-avidin系统检验表明在表面结合ATRP和点击化学的可行性;Si表面在接枝polySBMA和Pra AMP后,XPS结果显示表面C 1s和N 1s分峰均出现多肽内肽键对应的分峰,并出现SBMA的N+,表明polySBMA和Pra AMP成功接枝于模型表面,并且实验组固定的抗菌多肽量少于对照组的。水接触角、AFM也提供了该结果相关的辅助证明。对照组和实验组表面抗菌性能均达到99%以上,同时结合了polySBMA的实验组表现出更好的抗酶解性能,在1 mg/ml胰蛋白酶下5分钟后实验组的抗菌率仍然达到84.80%,对照组的抗菌率只有31.58%;Pra AMP在接枝到表面后对小鼠间充质干细胞并未表面出明显的毒性。本课题还探索了抗菌多肽在溶液中和在表面的杀菌机理。核酸类物质的泄漏表明,抗菌多肽是通过破坏细菌细胞膜,使其细菌胞体内容物流失致死,而SEM、TEM等结果能直观地观察到细胞膜上的孔洞以及细菌内容物的流失。荧光泄漏实验表明AMP在溶液中抗菌多肽对大肠杆菌细胞膜形成的孔洞大于9 nm而小于23 nm。
【图文】：
图 1-1 抗菌多肽明确的二级结构[22]：α-螺旋的 LL37, β-折叠的 protegrin-1, α-螺旋/β-折叠混合结构的人 β-defensin 2, 不规则结构的 indolicidin. 二硫键用黄色短棒表示。Figure 1-1 Antimicrobial peptides with distinct representative secondary structures[22]: α-helical of LL37, β-turn/sheet of protegrin-1, mixed α/β structure of human β-defensin 2, andrandom indolicidin. Disulfide bonds are represented by yellow sticks.此外，抗菌多肽在溶液中和在细菌胞膜上可能会展现出完全不相同的二级结构。大多数情况下，从溶液到水-膜界面，再到细菌胞膜的内部，抗菌多肽表现出极其复杂的二级结构转变过程（如果发生多肽插入细菌胞膜的情况，这取决于抗菌多肽、细菌胞膜和环境的相互作用）[23]。虽然那些含有二硫键的多肽在不同环境中的二级结构是否有所改变还不确定，，因为通常假设二硫键是有助于稳定多肽二级结构的，而那些不含有二硫键的抗菌多肽在结合可插入到细菌胞膜的时候通常会发生较大的构象变化。此外，也存在一些缺乏改变构象能力的多肽。1.1.1.2 抗菌多肽的性质
图 1-2 抗菌多肽的作用机制模型[45]。(A) 环孔模型(toroidal)、(B) 地毯模型(carpet-like)、(C) 桶-板模型(barrel-stave)以及（D）聚合通道模型（aggregate channel）Figure 1-2 Mode of action of AMPs[45]. (A) toroidal, (B) carpet-like (C) barrel-stave and(D)aggregate channel1.1.3.2 非膜机制除了与膜相互作用的能力外，有越来越多的证据表明，抗菌多肽有其它的细胞内目标。它们可以有多种细胞内目标，可以结合 DNA，RNA 和蛋白质，抑制细胞壁的合成和 DNA，RNA 或蛋白质的合成。此外，多肽能通过在体外或体内扰乱细胞壁的形成干扰细胞分裂。他们通过独特机制转运到细胞质中，从而改变细胞膜的形成，抑制细胞壁的合成，抑制核酸的合成，抑制蛋白质的合成或抑制酶的活性。1.2 两性离子聚合物两性离子聚合物是一种聚合链中同时具有阳离子基团和阴离子基团，偶极距极高且总电荷却为零的一类聚合物，其具有独特的“反聚电解质效应溶液行为”[47-49]，即其黏
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TH77;TB306
本文编号：2662620
【图文】：
图 1-1 抗菌多肽明确的二级结构[22]：α-螺旋的 LL37, β-折叠的 protegrin-1, α-螺旋/β-折叠混合结构的人 β-defensin 2, 不规则结构的 indolicidin. 二硫键用黄色短棒表示。Figure 1-1 Antimicrobial peptides with distinct representative secondary structures[22]: α-helical of LL37, β-turn/sheet of protegrin-1, mixed α/β structure of human β-defensin 2, andrandom indolicidin. Disulfide bonds are represented by yellow sticks.此外，抗菌多肽在溶液中和在细菌胞膜上可能会展现出完全不相同的二级结构。大多数情况下，从溶液到水-膜界面，再到细菌胞膜的内部，抗菌多肽表现出极其复杂的二级结构转变过程（如果发生多肽插入细菌胞膜的情况，这取决于抗菌多肽、细菌胞膜和环境的相互作用）[23]。虽然那些含有二硫键的多肽在不同环境中的二级结构是否有所改变还不确定，，因为通常假设二硫键是有助于稳定多肽二级结构的，而那些不含有二硫键的抗菌多肽在结合可插入到细菌胞膜的时候通常会发生较大的构象变化。此外，也存在一些缺乏改变构象能力的多肽。1.1.1.2 抗菌多肽的性质
图 1-2 抗菌多肽的作用机制模型[45]。(A) 环孔模型(toroidal)、(B) 地毯模型(carpet-like)、(C) 桶-板模型(barrel-stave)以及（D）聚合通道模型（aggregate channel）Figure 1-2 Mode of action of AMPs[45]. (A) toroidal, (B) carpet-like (C) barrel-stave and(D)aggregate channel1.1.3.2 非膜机制除了与膜相互作用的能力外，有越来越多的证据表明，抗菌多肽有其它的细胞内目标。它们可以有多种细胞内目标，可以结合 DNA，RNA 和蛋白质，抑制细胞壁的合成和 DNA，RNA 或蛋白质的合成。此外，多肽能通过在体外或体内扰乱细胞壁的形成干扰细胞分裂。他们通过独特机制转运到细胞质中，从而改变细胞膜的形成，抑制细胞壁的合成，抑制核酸的合成，抑制蛋白质的合成或抑制酶的活性。1.2 两性离子聚合物两性离子聚合物是一种聚合链中同时具有阳离子基团和阴离子基团，偶极距极高且总电荷却为零的一类聚合物，其具有独特的“反聚电解质效应溶液行为”[47-49]，即其黏
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TH77;TB306
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本文编号：2662620
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