超连续激光散射光片显微镜的构建和应用

发布时间：2020-06-12 00:21

【摘要】：在过去的二十年中,由于其独特的光学特性,能够引起局域表面等离子体共振(LSPR)散射和吸收的贵金属纳米颗粒(MNP)已经引起相当大的关注,并已经在材料科学,化学以及生物传感,疾病诊断和治疗等领域得到了广泛应用。目前针对MNP已经开发了许多显微成像技术,如暗场显微术,微分干涉相差显微术,正交偏振显微术,热成像以及瞬态吸收成像等。但与荧光信号不同的是,LSPR的检测信号与入射光信号具备相同的检测波长,因此无法通过滤光片消除背景,导致对单粒子散射检测的严重干扰。据我们所知,迄今为止,在高瑞利散射背景系统(如毛细管,三维细胞或组织成像)中还没有令人满意的成像模式。最近,由于其在光学切片活体生物样品如胚胎,细胞和组织中运用,光片显微镜或平面照明显微镜(SPIM)已经获得了众多研究者的关注。在典型的SPIM设置中,通过一系列光学器件的薄片光以90度照射样品,同时也垂直于收集发射光的物镜光轴。这样有两个明显的优势,第一,当光片的厚度与透镜焦点的深度相匹配时,理论上在焦平面外的样本将不会被照射,导致沿垂直方向具有高分辨率的图像,最小离焦背景和最小的瑞利散射背景;第二,由于入射光垂直于检测物镜,激发光并不会进入物镜收集,从而导致极低的背景,也就是天然享有暗场显微镜的优势。然而,现有的SPIM设置都是以荧光显微镜为基础开发的,目前还没有关于光片LSPR散射成像的报道。本文针对上述问题进行研究,主要包括以下内容:(1)以传统光片照明显微镜的原理为基础,对光源,探测器等光学元件进行了优化,采用超连续激光为光源,研制出具有高灵敏度,高信噪比,高时空分辨率和各向异性分辨率的光片LSPR散射成像技术。每个光学元件的优化和仪器的设计都是在经典瑞利散射公式的指导下进行的。利用光片照射技术,我们将其与毛细管系统结合起来,实现了毛细管中MNP粒子的成像,并获取毛细管中纳米粒子信息的一些信息,包括散射光强度,光谱,数量等。鉴于等离激元金属纳米颗粒在各个领域的应用快速增长,我们预计这种高灵敏度和高通量等离子体激元成像技术可能有助于表征和评估MNPs以及它们与周围环境的动态相互作用。(2)为了实现对严重急性呼吸系统综合症(SRAS)的超高灵敏度分析,基于金纳米颗粒优良的光学性质和生物相容性,利用我们所搭建的单层超连续激光光片显微镜,我们成功实现了在单分子水平上对与SRAS相关的DNA序列的检测。该技术是是利用Au-ssDNA纳米粒子探针与溶液中目标ssDNA杂交形成聚合体的效应来实现的。应用所搭装置对散射信号的收集,对DNA杂交前后的颗粒进行成像并计数,通过对18 nm金颗粒数目减少量的统计实现了对目标DNA浓度的检测。此外,由于核酸外切酶I(Exo I)对于DNA的复制、重组、修复起着重要作用,我们利用所搭建的单层超连续激光光片显微镜,发展了一种高效、快速的方法对酶浓度进行了检测。其检测原理是基于核酸外切酶I对DNA的酶切反应会诱导13 nm金颗粒发生团聚反应。利用我们所搭建的装置对金颗粒团聚体进行单分子成像并计数,发现酶浓度的对数值与13 nm金颗粒聚集体数目具有良好的线性关系。(3)利用我们所搭建的激光单层照明光片成像系统,结合毛细管-缺口管阵列进样系统,对单个金纳米棒在氧化过程中的动力学行为进行考察,通过分析其颜色、强度、光谱、电迁移率等变化趋势,我们发现了表面带有不同修饰物的金纳米棒的氧化行为的差异以及金纳米棒在氧化过程中表面带电量的变化,进一步揭示了金纳米棒的氧化反应机理。(4)由于细胞内流体粘度与生命运行以及疾病的发生密切相关,而目前能够实现活细胞成像的粘度探针还比较少,因此,我们结合金纳米探针优异的光学性能以及良好的生物相容性,利用我们所搭建的激光单层光片成像系统,对细胞微环境中金纳米粘度探针的构建进行探索。在此,我们研究了溶液粘度对金纳米棒转动的影响,推导了相关公式并发现金纳米棒的转动行为与环境粘度具备线性相关。(5)创建和扩大色差和提高数字成像的色彩分辨率对于更好地应用色彩分析至关重要。在此,我们通过使用自制的可调谐多波段激光照明装置开发了新的颜色调制分析策略,其中照明光的R,G和B分量的部分可以任意调节,并且因此可以连续调节样本在RGB色彩空间中的颜色。与传统的连续光源照明不同,多波段激光照明可以扩大样品之间的颜色分离,因此可以在颜色分析中获得高光谱灵敏度。使用该仪器采用单个Ag@AuNR作为硫化物探针,我们实现了硫化物的高通量和高灵敏度检测,检测限为0.1 nM,比传统的紫外检测模式提高了2个数量级以上。该策略可用于生物成像和生物化学分析中的纳米颗粒识别,评估和测定,并有望用于人脸识别和防伪技术中。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TH742

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