基于照明调制的超分辨方法

发布时间：2020-07-19 10:56

【摘要】：光学显微镜,作为科学研究观察的重要工具,被广泛应用于化学、生物、以及材料科学等领域中。但是,因为1873年被提出的阿贝衍射极限的存在,如何获得更高的分辨率一直困扰物理学家们。在衍射极限被提出后的近一个世纪内,科学界普遍认为衍射极限就是光学分辨率极限。这里,分辨率极限可以通过一个模型来代表,被测样品可以当作是一个由不同周期组成的光栅的集合,可以通过收集物镜的最高空间频率可以用Kc= 2πNA/λ表示,Kc怂代表了光学传递函数的截止频率。这种情况使得光学分辨率被局限在二分之一的波长,在1968年,作为第一个光学超分辨显微方法,共聚焦显微镜被提出来去绕过衍射极限的限制。共聚焦显微镜的背后机理是空间上辐射点扩散函数(PSF)和搜集点扩散函数的乘积(频率域上对应的是二者傅里叶变换的乘积),这使得对应系统的有效OTF被拓宽到超越宽场的极限。这个突破也潜在于一个本质,那就是衍射极限不仅影响着探测PSF,同时还影响着照明PSF。同时,照明PSF在激发样品上荧光时,又把自己的空间频率转化到样品频率上,这也是其他超分辨显微方法的基础,虽然没有真正的去打破衍射极限,但是通过控制照明-激发-辐射的来产生非线性激发,很好地达到了超分辨。因此,通过照明调制来调控激发图样,获得更高的空间频率。对于空间高频分量进行解调,获得超分辨信息。这两步是本文的重点。学位论文结构如下:1.介绍超分辨的历史,应用场景现在主要面临着特殊荧光标记、图像采集时间长、分辨率高的问题。对于这些问题从成像过程和频域角度给予总结性评价。并且给出若干可行的解决方法。2.第二章,提出基于荧光辐射差分显微方法的改进。在这个章节内提出了I,可以实现三维超分辨的3D-FEl)超分辨方法;II,通过荧光饱和效应同时实现分辨率提高和畸变减小的饱和FED超分辨方法远场荧光显微镜在很长的一段时内一直受限于阿贝衍射极限。因此,它在纳米级应用中的表现一直不尽人意。尽管电镜技术可以提高分辨,但他们并不能被直接应用干观察活细胞并且也没有打破衍射极限。在已经提出来的超分辨显微方法中,荧光辐射差分显eu术利用了相减方法去探究超分辨,他也可以被利用于去观察一些生物样品同时下需要特殊荧光染料的需求。虽然FED的分辨能力比STED要差不少,但是因为它的直接性,简便性有着可以广泛应用的前景。先前关于这方面应用有二次谐波FED,双光子FED,以及相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜。此外,相对于其他不需要样品受限的方法,FED需要更少的采集时间以及后处理,相对于结构光照明显微方法。但是,先前的FED在相减过程中有着畸变和信息N失的风险。特别是相减系数增加的时候,会有明显的负值。并且FED的分辨率也受限于空心光斑中心半径的大小。这种负值带来的负面影响在对密集样品成像时会更加明显。我们通常将负值归零的方法会把很多有用信号给抹去。在之前的探索中,荣等人使用过柱状矢量光FED去获得一个中心缩小的空心以及横向扩大的是实心光斑。虽然先前的方法从一定程度上减小畸变,但是程度依然不够用于在密集样品成像。另外在先前方法中空心光斑的中心依然很大,影响了最终的分辨率提高。在此章中我们利用了饱和非线性效应去产生两种激发光,一种是中心缩小的空心光斑,一种是边缘扩大的实心光斑。利用这两种光斑进行相减,可以一方面减小负值,也可以另一方面去通过缩小中心的空心斑来增加分辨率。在这里我们利用对于罗丹明6G的样品仿真来进行初步证明。同时实验上我们也对生物样品或者纳米颗粒去证明。在4Onm荧光颗粒的成像结果得到108 nm的分辨率。通过对于微管的超分辨成像中我们获得了 175nm的分辨率。在此章的另一部分,我们利用了一个相位型空间光调制器来产生轴向和横向的空心光斑。利用实心光斑产生的图像与这两者图像进行相减,我们得到了 3D的超分辨结果。3.第三章,提出了基于饱和吸收竞争的超分辨显微方法,也在这章中首次在实验和方针上验证了此类超分辨方法的可行性。在开发超分辨显微镜时候,饱和效应被去广泛用于产生荧光激发和辐射之间的非线性效应。饱和激发显微镜(SAX)利用一个非线性响应去激发在激发态的荧光分子去提出高频分量,从而去获得物理超越衍射极限外的结构信息。STED以及其他可你饱和转换显微方法,则利用受激辐射去抑制自发辐射以及去进一步通过饱和效应去抑制。目前最好的STED效果达到2.4 nm的分辨额能力。因为STED可以获得纳米级的分辨率,它目前被更广泛地使用和探索。在STED)过程中,一个高波长耗尽空心光斑将光子转换到暗态,此时产生的受激辐射和自发辐射之间的竞争得到一个衍射极限的PSF。在这里我们把这步骤称之为后竞争因为它产生在荧光激发的过程中。对应的另外一种前置竞争是基态耗尽方法(GSD)。在GSD,荧光是被通过转换到T1态来实现开关。此外,还有其他两种超分辨方法利用了饱和吸收。Wang等人引入了笫三束光到pump-probe过程来实现非荧光吸收过程的饱和。虽然也同时带来了更复杂和昂贵的系统。Yang等人利用了饱和激发过程并利用共振从中提出重叠的荧光。但他们的方法需要去在液态氦来冷却以及恃殊的荧光分子。这种特殊的限制使得他们很难被应用于实际观测,比如生物成像。因此,证明一种超分辨的,利用单束连续光在光吸收饱和下的竞争,在室温环境下能够使用方法迫在眉睫。在此章,我们提出了一种前置竞争方法,利用了两束入射光在吸收态下的竞争去开发饱和竞争过程并且利用了锁相零差解调方法去分离出混叠的荧光信号。同时实验上用80nm大小的细胞核孔复合物以及荧光颗粒证明了 100 nm也就是1/6波长的空间分辨率。在此章中,我们还相信讨论了荧光漂白情况,实验的具体细节以及此章出方法和结构光成像(SIM)的对比。4.第四章,提出并验证了非线性焦斑调制的超分辨显微方法。在这章我们报道了非线性焦斑调制显微方法来应用于超分辨成像。存过去20年,我们看到很多坐标固定超分辨方法(对应于STORM、PAl,M等坐标随机超分辨方法)。他们几乎都是通过控制照明光束从而调制出想要的,以及更具有信息量的光学图案。对应的照明光学图案可以被归类为结构光或者点照明。他们被广泛应用于结构光照明显微镜和共聚焦显微镜中。因为高光强对于超过两倍的分辨率提高很有用,STED和SSIM这类利用饱和非线性的去缩小高斯辐射光斑大小的方法。由STED证明聚焦照明是一个很好地去实现高光强饱和的方式并且在深度成像中能够保持较高的光强是主要原因。虽然避免了像SSIM那样需要一大堆采集图像,STED依然有着诸如不能够完全耗尽,对于多色样品或者长激发光谱样品不够灵活的问题。其中,高波长高功率的耗尽光带来的再激发是重要问题。虽然在近来有方法通过引入额外的空心光的图案进行相减的方法减轻再激发问题,或者精致地去选择荧光染料的方法去减轻,但是带来更大的系统复杂度。另外,由于极度依赖两束光斑的对准以及空心斑中心的完美程度,STED在深度成像中受到相差等的限制,最后,STED和SSTM都需要一高光强的光源和复杂的光学系统,限制了他们去被更广泛的应用。近来,几个研究组利用了基于结构光的算法来后处理图像扫描显微镜(ISM)以图能够在线性或者非线性激发的情况下得到额外的收获。但是,在他们的系统中他们利用的一个高斯照明图案非常限制了他们的分辨率的提高,尤其在饱和的情况下。在此章我们通过去寻找一个可行的并且灵活的,继承之前共聚焦系统方法去突破两倍的分辨率。换句话说,我们问一个问题,给定一个聚焦照明情况下并且限定参数,什么样的激发方案能够带来一个物体的空间结构信息并同时能够很容易去实施。当我们回复过去的点扫描超分辨方法,我总结过去的方法都是在达到一个目的,那就是通过各种方法不断去缩小激发的PSF。比如通过贝塞尔光束,超振,偏振调制或者减小小孔大小,通过散射介质成像等方法去缩小或者是简洁的通过去剥去激发PSF的光斑来达成。但是,当我们考虑移频原理,我们发现超分辨方法不一定需要去让PSF足够小来告诉我们物体的具体位置而是,去不断扩大整个系统痛辐射图案的频率覆盖来达到超分辨。因此,在这章中我们强调移频作为点扫描照明显微中一个根本的机理并且引入了非线性焦点调制(NFOMM)显微方法,作为利用高光强调制光斑扫描的显微方法。在NFOMM中,我们通过合理的照明光场调控(饱和激发通过高强度照明和频率移动的照明PSF通过相位调制),显著的物体高频信息被通过非线性激发来保留下来。当移动物理高频信息过程结束后,我们利用系统的前向模型后处理这些采集图像最终得到超分辨图像。在此章中,我们验证了 NFOMM能够达到60nm也就是十分之一波长的分辨率。我们也验证了 NFOMM的双色成像能力并用细胞核孔证明了 NFOMM有着不亚于STED的成像分辨能力。因为NFOMM可以应用于普通共聚焦系统时只需要额外引入一个空间光调制器并且非常容易去对准,我们期望它能够被迅速广泛应用,从而帮助生物观测。5.第五章,提出并验证了利用结构光照明提高SOFI分辨率的方法。通过分析闪烁体的随机时空涨落,SOFl得到了超分辨信息同时比之于定位超分辨方法(比如STORM和PALM)限制更少,更适用于低信噪比的情况。但是,由于S0FI先前的分辨率受限于累计几次的平方根关系,分辨率提高不足因此限制它向很多高分辨观察的广泛引用。在此章,我们抛弃了默认的在随机成像中的平场照明,转而引入结构光照明(比如高斯或者正弦条纹)到SOFl;成像中去很大程度上提高分辨率。通过根据采集中的实际参数和显微镜的特性,我们验证了结构光SOFI的原理并且仅用二阶累积就实现了4-6倍的分辨率提高。作为参照,之前二阶累积只能实现(?)2倍的分辨率提升。在这章,我们也给出了结构光S0F1用于实验实现的重建方法。利用结构光照明的SOF1成像在空间分辨率上能够轻易达到40-60nm。在之后的应用中我们期望它能和STORM等中心定位方法产生互补。从而带来更好,更全面的分辨率提升选择。6.对于文中所做工作的总结、展望。目前超分辨方法种类繁多,但是实际上有效可用的非常少。从速率分辨率两个角度来说,STED是最可行的方法。但STED在具体应用叶中受限很大。在此文中,我利用荧光饱和效应,提出了几种更直接,便捷的方法。其中在第四章中的NF0MM方法最为简洁,且分辨能力优异,具有在材料成像,多色成像中取代STED成像的优点。我期待这些技术以后能被更多地应用于生物观测中。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TP391.41;TH742

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