小型化光片荧光显微成像系统研制及其应用研究

发布时间：2020-10-09 15:46

　　 光片荧光显微成像技术凭借其优异的三维成像能力、单细胞尺度分辨率、快速成像性能和更低光毒性和光漂白性等优点,目前正被广泛应用于生物医学研究。随着成像应用的深入,光片荧光显微成像系统中存在的问题和不足也亟需研究和解决,包括系统移植性差、商业化光片成像系统价格昂贵、多通道同步光片荧光成像能力不足、样品的操控较为复杂及分辨率和成像视野之间难以调和的矛盾等。本文围绕光片荧光显微成像技术中存在的上述问题进行了研究和优化,设计得到了功能多、用途广泛且与常规倒置荧光显微系统兼容的小型化光片荧光显微成像系统,并通过实际的生物成像应用展示了该系统具有的先进技术和优异性能。具体研究内容包括:首先,基于光片荧光显微成像原理,采用紧凑的照明光路设计及硬件集成化,提出并设计了兼容宽场倒置荧光显微镜的小型化光片荧光显微成像系统。采用图像分割光路设计,提出了双通道同步光片荧光成像技术。根据柱面镜光片生成原理,设计了改变入射光厚度及透镜焦距的照明光片厚度调节机制,满足不同尺寸生物样本的成像需求。活体斑马鱼胚胎三维荧光成像及心跳血流高速动态成像实验表明,小型化光片荧光显微系统能实现照明光片厚度可调,且在获得高对比度图像同时,轴向分辨率相比于常规宽场荧光显微镜有数十倍提升。然后,研究了基于小型化光片荧光显微成像系统的三维体像素超分辨算法,推演了实际物理成像过程中的图像退化模型,通过最大似然估计方法,建立了基于三维图像堆栈序列亚像素位移信息的图像超分辨重建数学模型。提出了空间斜轴扫描技术,发展并研究了分辨率增强光片荧光显微成像系统。通过系统点扩散函数测量及斑马鱼和鼠脑样本的超分辨对比成像实验,验证了三维超分辨成像系统能在实现4X/0.16低倍物镜的成像视野同时,达到10X/0.4高倍物镜的横向分辨率且三维成像的轴向分辨率亦有2~3倍提升,以此实现大视野高分辨成像。最后,将微流控技术运用到光片荧光显微成像技术中,提出了基于小型化光片荧光显微成像系统的光流控三维成像技术。通过光流控三维成像技术原理分析,研究了样品自扫描光片三维成像技术实现过程。阐述了光流控芯片制作流程,通过光学侧面平整技术,减少了光信号散射,提高了系统光片成像性能,为光流控技术的应用提供了必要的技术支持。通过微液滴成像实验,实现了微液滴体积尺寸及颗粒浓度的精确量化分析,验证了光流控成像技术的三维成像能力。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：TH742.65
【部分图文】：

1.1 研究背景与意义亘古至今，人们从来没有停止过对微观世界的认知。在这过程之中，显微成像技术伴随着人们对微观世界的深入探索而不断地发展。显微意味着借助成像工具实现了仅凭靠人类肉眼无法实现的对微小事物的观察。显微镜则是其中最为重要的工具之一。显微镜的出现，弥补了人们直接通过裸眼无法进一步观察细微事物或者微观结构的不足，开启了人们对微观世界研究的大门。显微成像技术是伴随着生命科学研究的深入而不断发展的。从 17 世纪，虎克显微镜的发明，人类第一次看到了植物细胞的结构。到 20 世纪上半叶，相差显微镜的发明，使得观察未经染色的透明活细胞成为可能。而随着荧光蛋白的发现，以及生物荧光标记技术的发展，激光共聚焦显微镜应运而生。使用激光共聚焦显微镜，能够实现对多细胞的组织进行三维的扫描、重构，从而追踪细胞在真实三维空间中的演化和发展。而近十年来，尖端的光片荧光显微成像技术的出现，又将三维显微成像技术向更高的时间和空间分辨率作了极大的推进。

科 技 大 学 博 士 学 位 论 和信号的采集方式发生了极大的变化，因此不断推动[2-6]。尤其随着新型的生物荧光染料和转基因荧光标记荧光显微成像技术应运而生。荧光显微成像作为对微细胞事件的强有力观察手段，从诞生以来一直是现代技术。随着荧光显微成像技术在生命科学研究中的的新纪元[7]。

图 1-3 基于光片荧光成像的三维肿瘤细胞团：(a)最大值投影三维细胞团图像；(b)细胞团截面图像[12]在发育生物学中，对生物器官组织乃至全胚胎的研究也在逐步向三维空间发展。虽然平面二维图像能在一定程度上满足科研者们对细胞形态、体内器官组织结构及全胚胎发育情况研究的需要。但是通过单一的平面投影图像能得到的信息往往是很有限的。在实际的生命个体中，其器官组织具有三维形态，体内结构细胞的生长发育形态也具有空间性。除此之外，实现生命机能的功能细胞分布于各个器官组织中，因此其分布同样具有空间性。在对样本进行更准确和严谨的发育生物学研究时，研究者们往往需要在真实三维形态下对样本进行更加精细的统计分析。例如通过对胚胎的三维成像，Irene Wacker 等人实现了对斑马鱼全胚胎中所有免疫细胞的定量分类统计，并在三维的免疫突触统计分析结果中，研究了胸腺细胞和肾髓细胞在与癌细胞联合培养时的细胞毒性反应[18]。在 2008 年，Philipp J. Keller 等人通过对早期斑马鱼胚胎发育过

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本文编号：2833883