光片照明显微方法与系统研究
发布时间：2021-02-12 02:38
在荧光显微镜的发展历程中,研究的重点关注方向一直在发生变化。从开始时的对系统分辨率的关注到如何对样品更深位置的成像,而近年来重点逐渐转向了荧光显微镜如何更好地应用于实际的生物成像中。光片照明显微镜以其对样品的低损伤以及快速成像的特性,逐渐被生物学家所接受并成为主流的观察长时间生物过程的手段。然而由于光束的衍射特性,光片照明显微镜存在大视场和高轴向分辨率的取舍问题。基于以上背景,本论文在光片照明显微镜方面进行研究,主要工作如下:（1）设计并搭建一套大视场光片照明显微系统。通过联合贝塞尔光束照明和滚动曝光的方式,在保证高轴向分辨率的同时,扩大系统的视场。此外,编写了系统控制软件,并对斑马鱼等样品进行成像实验。实验表明该系统轴向分辨率达到3μm,单幅视场达到800μm以上,达到设计指标。（2）搭建一套小视场三维高分辨的晶格光片照明显微镜。通过双层光路,监测相机系统和套筒结构的创新设计,降低了系统的调节难度,提高系统的稳定性。完成显微镜系统控制软件,实现了系统设计目标,系统稳定性得到提高。（3）对光片照明显微镜的轴向分辨率提升进行相关研究。对于普通光片照明显微镜,提出模式调制光片照明显微镜的方...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１光片照明显微镜简化原理图蓝色箭头代表激发光，绿色箭头代表反射光或荧光）??光片的产生方式通常有两种，一种方式是通过柱面镜对准直后的光束进行聚焦，即可??
应??用都是为了在具体的成像要求中，产生最有利于观测的光片照明显微镜的参数，包括分辨??率，视场，层析能力等。下面，本文将对几种常见且较有影响力的光束调制技术在光片照??明显微镜中的应用进行分析及说明。??１．２．１．１贝塞尔光束??贝塞尔光束是在光片照明显微镜中最广泛应用的利用光束整形技术的例子｜１７￣１８］。相比??于同样最大通光直径的高斯光束，贝塞尔光束在保持轴向分辨率的同时极大地增加了成像??视常贝塞尔光束是抗衍射光束的一种，其横截面由满足贝塞尔分布的多圈圆环组成，如??图１－２所示。理想的贝塞尔光束传播时不受衍射影响，即与高斯光束不同，理想的贝塞尔??光束主瓣不会随着传播而改变形状。此外，贝塞尔光束还具有自愈合特性。在贝塞尔光束??传播时，对于传播光路上可能存在的较小的障碍物，贝塞尔光束可以继续进行传播，而不??受到障碍物的影响１１９］。然而，理想的贝塞尔光束在物镜后焦面上的截断形状为一个宽度无??限小的环，在实际使用中会导致光的利用率极低。所以一般在应用时会将环的宽度略微增??加，这会使得贝塞尔光束在长距离的传播中会有所展宽，但是依然具有极明显的增加视场??的作用。??Ｉ??！??图１－２贝塞尔光束横截面及沿径向强度分布［２〇】??１．２．１．２光学晶格??光学晶格，如图１－３所示，同样是抗衍射光束的一种。不同于贝塞尔光束在物镜后焦??面的圆环内强度分布均句，光学晶格在物镜后焦面的强度分布同样被限制在圆环内，但是??圆环内具有一定强度分布，具体的分布可以通过精密的计算得到。相比于高斯光片，光学??晶格更适合于高分辨率的亚细胞结构成像。光学晶格在光片照明显微镜中的应用由单个贝??塞尔光束与多个贝塞尔光
浙江大学硕士专业学位论文?１绪论??个分立且彼此之间的距离小到一定程度时的贝塞尔光束彼此干涉的结果［２２】。在光片照明显??微镜中的应用，光学晶格将原本聚焦的光束分为了空间分布的阵列，极大地降低了照射到??样品上的功率。对于晶格光片照明显微镜，当入射样品的激光总功率一定时，晶格光片照??明显微镜相比于普通的光片照明显微镜，会提供更高的轴向分辨率，并极大地降低对样品??的光漂白与光损伤［２３］。??■??图１－３光学晶格横向截面强度??１．２．１．３艾利光束??艾利光束也是一种抗衍射光束，如图１－４?（ａ）所示。但是不同于贝塞尔光束及其各种??变体，艾利光束不由锥形分布的光矢量叠加而成｜２＜２５１。艾利光束最明显的特征为在传播时，??虽然艾利光束的横截面强度保持不变，但是传播的路径为曲线。正因为如此，艾利光束也??被称为“自加速光束”［２６］。与贝塞尔光束相同，艾利光束也具有自愈合特性，所以艾利光??束在散射较强的介质中成像时往往具有相对普通高斯光片好的多的结果。在光片照明显微??镜中，艾利光束的这些特性可以被用来产生很薄的光片，提供成像所需的高分辨率，甚至??可以产生各向同性的空间分辨率［２７１。??艾利光片效率最高的产生方式是用空间光调制器产生如图１－４?（ｂ）所示的立方相位，??并结合扫描光束产生虚拟光片的方法。此外，使用倾斜的平凸柱面镜或者一维立方相位掩??模板也可以用来直接产生艾利光片［２８１。??艾利光片可以提供同等分辨率下高斯光片十倍以上的视常此外，艾利光束不需要像??贝塞尔光束，利用额外的方法，如滚动曝光等方式消除旁瓣的影响。艾利光束的旁瓣所产??生的影响只需要通过反卷积的方式就可以消除，且反卷积后
本文编号：3030116
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１光片照明显微镜简化原理图蓝色箭头代表激发光，绿色箭头代表反射光或荧光）??光片的产生方式通常有两种，一种方式是通过柱面镜对准直后的光束进行聚焦，即可??
应??用都是为了在具体的成像要求中，产生最有利于观测的光片照明显微镜的参数，包括分辨??率，视场，层析能力等。下面，本文将对几种常见且较有影响力的光束调制技术在光片照??明显微镜中的应用进行分析及说明。??１．２．１．１贝塞尔光束??贝塞尔光束是在光片照明显微镜中最广泛应用的利用光束整形技术的例子｜１７￣１８］。相比??于同样最大通光直径的高斯光束，贝塞尔光束在保持轴向分辨率的同时极大地增加了成像??视常贝塞尔光束是抗衍射光束的一种，其横截面由满足贝塞尔分布的多圈圆环组成，如??图１－２所示。理想的贝塞尔光束传播时不受衍射影响，即与高斯光束不同，理想的贝塞尔??光束主瓣不会随着传播而改变形状。此外，贝塞尔光束还具有自愈合特性。在贝塞尔光束??传播时，对于传播光路上可能存在的较小的障碍物，贝塞尔光束可以继续进行传播，而不??受到障碍物的影响１１９］。然而，理想的贝塞尔光束在物镜后焦面上的截断形状为一个宽度无??限小的环，在实际使用中会导致光的利用率极低。所以一般在应用时会将环的宽度略微增??加，这会使得贝塞尔光束在长距离的传播中会有所展宽，但是依然具有极明显的增加视场??的作用。??Ｉ??！??图１－２贝塞尔光束横截面及沿径向强度分布［２〇】??１．２．１．２光学晶格??光学晶格，如图１－３所示，同样是抗衍射光束的一种。不同于贝塞尔光束在物镜后焦??面的圆环内强度分布均句，光学晶格在物镜后焦面的强度分布同样被限制在圆环内，但是??圆环内具有一定强度分布，具体的分布可以通过精密的计算得到。相比于高斯光片，光学??晶格更适合于高分辨率的亚细胞结构成像。光学晶格在光片照明显微镜中的应用由单个贝??塞尔光束与多个贝塞尔光
浙江大学硕士专业学位论文?１绪论??个分立且彼此之间的距离小到一定程度时的贝塞尔光束彼此干涉的结果［２２】。在光片照明显??微镜中的应用，光学晶格将原本聚焦的光束分为了空间分布的阵列，极大地降低了照射到??样品上的功率。对于晶格光片照明显微镜，当入射样品的激光总功率一定时，晶格光片照??明显微镜相比于普通的光片照明显微镜，会提供更高的轴向分辨率，并极大地降低对样品??的光漂白与光损伤［２３］。??■??图１－３光学晶格横向截面强度??１．２．１．３艾利光束??艾利光束也是一种抗衍射光束，如图１－４?（ａ）所示。但是不同于贝塞尔光束及其各种??变体，艾利光束不由锥形分布的光矢量叠加而成｜２＜２５１。艾利光束最明显的特征为在传播时，??虽然艾利光束的横截面强度保持不变，但是传播的路径为曲线。正因为如此，艾利光束也??被称为“自加速光束”［２６］。与贝塞尔光束相同，艾利光束也具有自愈合特性，所以艾利光??束在散射较强的介质中成像时往往具有相对普通高斯光片好的多的结果。在光片照明显微??镜中，艾利光束的这些特性可以被用来产生很薄的光片，提供成像所需的高分辨率，甚至??可以产生各向同性的空间分辨率［２７１。??艾利光片效率最高的产生方式是用空间光调制器产生如图１－４?（ｂ）所示的立方相位，??并结合扫描光束产生虚拟光片的方法。此外，使用倾斜的平凸柱面镜或者一维立方相位掩??模板也可以用来直接产生艾利光片［２８１。??艾利光片可以提供同等分辨率下高斯光片十倍以上的视常此外，艾利光束不需要像??贝塞尔光束，利用额外的方法，如滚动曝光等方式消除旁瓣的影响。艾利光束的旁瓣所产??生的影响只需要通过反卷积的方式就可以消除，且反卷积后
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