三维超分辨荧光和形貌显微镜联用系统的研制
发布时间：2021-11-23 05:26
搭建了一种联用超分辨荧光和三维形貌显微成像系统（Correlative super-resolution fluorescence and three-dimensional topography imaging microscopy）,以聚合纤维状肌动蛋白（F-actin）为例,评价了此联用系统的性能。实验结果表明,此联用仪器具有纳米级分辨率的三维形貌及具体成分的定位分布成像功能,可实现在形貌图中定位具体成分的功能,表明此联用仪器可应用于研究分析细胞骨架及细胞亚结构（如细胞膜蛋白质聚集体的组成和分布特性等）方面,此联用系统在生命科学和材料科学等领域具有广泛的应用前景。
【文章来源】：分析化学. 2020,48(02)北大核心EISCICSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
三维超分辨荧光和形貌显微镜联用系统示意图
为了考察三维超分辨荧光和形貌显微镜联用仪器的性能,采用G-actin在体外聚合形成的F-actin为测试样品,进行联用成像。如图2A所示,左侧图像为AFM形貌图,显示了一些纤维状凸起物及一些球形颗粒。根据文献[21]中报道的肌动蛋白结构,推测这些纤维状凸起物和球形颗粒分别为聚合F-actin和游离G-actin。此外,从AFM图像(如图2A左图)中观察到具有不同高度及宽度的纤维状凸起物,推测这是由于F-actin的聚合程度不同引起的。为测定AFM-dSTORM联用系统中的AFM成像模式能否提供高分辨图像,本研究选择宽度细小的低聚F-actin(如图2A左图中的白色箭头)及粒径小的游离G-actin(如图2A左图中的蓝色箭头)进行高度及半峰全宽的测定,并与文献[21]中报道的肌动蛋白尺寸进行比较, 以确定AFM成像的分辨率。通过对箭头处低聚F-actin和游离G-actin进行高度分布分析及高斯分布拟合,获得的低聚F-actin的高度及半峰全宽为10和30 nm(图2B上图),游离G-actin的高度及半峰全宽为7 和16 nm(图2B下图)。对比文献[21]中报道的单个G-actin直径(5.5 nm)及单聚F-actin直径(8 nm),发现箭头处的G-actin和F-actin的半峰全宽虽然由于AFM探针针尖的加宽效应而大于文献中报道的肌动蛋白尺寸,但测定的高度与文献[12]中肌动蛋白尺寸相符,因此,本联用系统中的AFM成像可实现对肌动蛋白的高分辨成像。图2C左侧图像为dSTORM图像,显示了特异性标记蛋白F-actin的分布,右侧图像为放大图,更清晰地揭示了F-actin的分布及聚合程度。为测定联用系统中的dSTORM成像分辨率,选择宽度细小的低聚F-actin区域(如图2C右图中的白色线条),并对其荧光强度分布进行高斯拟合,以测定F-actin的半峰全宽。如图2D所示,dSTORM图中所测得的低聚F-actin的半峰全宽为20～30 nm,比单聚F-actin的直径(8 nm)大,表明联用系统中的dSTORM成像可达到约20 nm的分辨率,与文献[14, 22]中报道的dSTORM分辨率(20 nm)相当。上述结果表明,搭建的联用仪器可实现dSTORM的超分辨荧光成像。为了将具体蛋白F-actin的分布精确定位到对应的三维形貌图中,需将形貌图中肌动蛋白的结构与基底区分。如图2A所示,通过设置阈值(基底的高度),可区分基底和肌动蛋白结构。为方便后续图像匹配优化,将小于等于阈值的高度值定义为0,即h=0代表基底; 将大于阈值的高度值减去阈值,即h值代表肌动蛋白的高度,且h>0代表肌动蛋白的结构。将提取的肌动蛋白三维结构与具体蛋白F-actin的分布导入MATLAB配准程序中,并根据AFM和dSTORM图中F-actin的结构,优化仿射变换参数以实现精确定位。如图3A所示,左侧图像为AFM形貌图,通过阈值扣除法将F-actin结构(红色区域)与基底(黑色区域)分割出来; 中间图像为经仿射变换后的dSTORM图像,展示了特异性标记蛋白F-actin的空间分布; 右侧图像为AFM形貌图和经仿射变换后的dSTORM图像间的叠加图,显示出具体蛋白F-actin在形貌图中的定位分布情况, 表明利用dSTORM成像得到的特异性标记蛋白F-actin的分布与AFM形貌图中的纤维状结构重叠,证明AFM-dSTORM联用显微镜能够将特定蛋白分子精确定位到AFM形貌图中。为进一步定量分析AFM和dSTORM图间的匹配效果, 通过比较dSTORM定位点出现在基底处(h=0)以及F-actin处(h>0)的几率来确定以及优化这两种图像间的重叠程度,即比较h=0及h > 0处的dSTORM定位点密度。如图3B所示,h > 0处的dSTORM定位点密度为2353 μm-2,而h=0处的dSTORM定位点密度只有318 μm-2,表明dSTORM定位点出现在F-actin处的几率大于出现在基底处,即证明AFM和dSTORM图像间的重叠程度很好。综上,此联用仪器可实现在单分子水平上对具体成分的空间分布和整体形貌间的关联分析。
为了将具体蛋白F-actin的分布精确定位到对应的三维形貌图中,需将形貌图中肌动蛋白的结构与基底区分。如图2A所示,通过设置阈值(基底的高度),可区分基底和肌动蛋白结构。为方便后续图像匹配优化,将小于等于阈值的高度值定义为0,即h=0代表基底; 将大于阈值的高度值减去阈值,即h值代表肌动蛋白的高度,且h>0代表肌动蛋白的结构。将提取的肌动蛋白三维结构与具体蛋白F-actin的分布导入MATLAB配准程序中,并根据AFM和dSTORM图中F-actin的结构,优化仿射变换参数以实现精确定位。如图3A所示,左侧图像为AFM形貌图,通过阈值扣除法将F-actin结构(红色区域)与基底(黑色区域)分割出来; 中间图像为经仿射变换后的dSTORM图像,展示了特异性标记蛋白F-actin的空间分布; 右侧图像为AFM形貌图和经仿射变换后的dSTORM图像间的叠加图,显示出具体蛋白F-actin在形貌图中的定位分布情况, 表明利用dSTORM成像得到的特异性标记蛋白F-actin的分布与AFM形貌图中的纤维状结构重叠,证明AFM-dSTORM联用显微镜能够将特定蛋白分子精确定位到AFM形貌图中。为进一步定量分析AFM和dSTORM图间的匹配效果, 通过比较dSTORM定位点出现在基底处(h=0)以及F-actin处(h>0)的几率来确定以及优化这两种图像间的重叠程度,即比较h=0及h > 0处的dSTORM定位点密度。如图3B所示,h > 0处的dSTORM定位点密度为2353 μm-2,而h=0处的dSTORM定位点密度只有318 μm-2,表明dSTORM定位点出现在F-actin处的几率大于出现在基底处,即证明AFM和dSTORM图像间的重叠程度很好。综上,此联用仪器可实现在单分子水平上对具体成分的空间分布和整体形貌间的关联分析。4 结 论
本文编号：3513219
【文章来源】：分析化学. 2020,48(02)北大核心EISCICSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
三维超分辨荧光和形貌显微镜联用系统示意图
为了考察三维超分辨荧光和形貌显微镜联用仪器的性能,采用G-actin在体外聚合形成的F-actin为测试样品,进行联用成像。如图2A所示,左侧图像为AFM形貌图,显示了一些纤维状凸起物及一些球形颗粒。根据文献[21]中报道的肌动蛋白结构,推测这些纤维状凸起物和球形颗粒分别为聚合F-actin和游离G-actin。此外,从AFM图像(如图2A左图)中观察到具有不同高度及宽度的纤维状凸起物,推测这是由于F-actin的聚合程度不同引起的。为测定AFM-dSTORM联用系统中的AFM成像模式能否提供高分辨图像,本研究选择宽度细小的低聚F-actin(如图2A左图中的白色箭头)及粒径小的游离G-actin(如图2A左图中的蓝色箭头)进行高度及半峰全宽的测定,并与文献[21]中报道的肌动蛋白尺寸进行比较, 以确定AFM成像的分辨率。通过对箭头处低聚F-actin和游离G-actin进行高度分布分析及高斯分布拟合,获得的低聚F-actin的高度及半峰全宽为10和30 nm(图2B上图),游离G-actin的高度及半峰全宽为7 和16 nm(图2B下图)。对比文献[21]中报道的单个G-actin直径(5.5 nm)及单聚F-actin直径(8 nm),发现箭头处的G-actin和F-actin的半峰全宽虽然由于AFM探针针尖的加宽效应而大于文献中报道的肌动蛋白尺寸,但测定的高度与文献[12]中肌动蛋白尺寸相符,因此,本联用系统中的AFM成像可实现对肌动蛋白的高分辨成像。图2C左侧图像为dSTORM图像,显示了特异性标记蛋白F-actin的分布,右侧图像为放大图,更清晰地揭示了F-actin的分布及聚合程度。为测定联用系统中的dSTORM成像分辨率,选择宽度细小的低聚F-actin区域(如图2C右图中的白色线条),并对其荧光强度分布进行高斯拟合,以测定F-actin的半峰全宽。如图2D所示,dSTORM图中所测得的低聚F-actin的半峰全宽为20～30 nm,比单聚F-actin的直径(8 nm)大,表明联用系统中的dSTORM成像可达到约20 nm的分辨率,与文献[14, 22]中报道的dSTORM分辨率(20 nm)相当。上述结果表明,搭建的联用仪器可实现dSTORM的超分辨荧光成像。为了将具体蛋白F-actin的分布精确定位到对应的三维形貌图中,需将形貌图中肌动蛋白的结构与基底区分。如图2A所示,通过设置阈值(基底的高度),可区分基底和肌动蛋白结构。为方便后续图像匹配优化,将小于等于阈值的高度值定义为0,即h=0代表基底; 将大于阈值的高度值减去阈值,即h值代表肌动蛋白的高度,且h>0代表肌动蛋白的结构。将提取的肌动蛋白三维结构与具体蛋白F-actin的分布导入MATLAB配准程序中,并根据AFM和dSTORM图中F-actin的结构,优化仿射变换参数以实现精确定位。如图3A所示,左侧图像为AFM形貌图,通过阈值扣除法将F-actin结构(红色区域)与基底(黑色区域)分割出来; 中间图像为经仿射变换后的dSTORM图像,展示了特异性标记蛋白F-actin的空间分布; 右侧图像为AFM形貌图和经仿射变换后的dSTORM图像间的叠加图,显示出具体蛋白F-actin在形貌图中的定位分布情况, 表明利用dSTORM成像得到的特异性标记蛋白F-actin的分布与AFM形貌图中的纤维状结构重叠,证明AFM-dSTORM联用显微镜能够将特定蛋白分子精确定位到AFM形貌图中。为进一步定量分析AFM和dSTORM图间的匹配效果, 通过比较dSTORM定位点出现在基底处(h=0)以及F-actin处(h>0)的几率来确定以及优化这两种图像间的重叠程度,即比较h=0及h > 0处的dSTORM定位点密度。如图3B所示,h > 0处的dSTORM定位点密度为2353 μm-2,而h=0处的dSTORM定位点密度只有318 μm-2,表明dSTORM定位点出现在F-actin处的几率大于出现在基底处,即证明AFM和dSTORM图像间的重叠程度很好。综上,此联用仪器可实现在单分子水平上对具体成分的空间分布和整体形貌间的关联分析。
为了将具体蛋白F-actin的分布精确定位到对应的三维形貌图中,需将形貌图中肌动蛋白的结构与基底区分。如图2A所示,通过设置阈值(基底的高度),可区分基底和肌动蛋白结构。为方便后续图像匹配优化,将小于等于阈值的高度值定义为0,即h=0代表基底; 将大于阈值的高度值减去阈值,即h值代表肌动蛋白的高度,且h>0代表肌动蛋白的结构。将提取的肌动蛋白三维结构与具体蛋白F-actin的分布导入MATLAB配准程序中,并根据AFM和dSTORM图中F-actin的结构,优化仿射变换参数以实现精确定位。如图3A所示,左侧图像为AFM形貌图,通过阈值扣除法将F-actin结构(红色区域)与基底(黑色区域)分割出来; 中间图像为经仿射变换后的dSTORM图像,展示了特异性标记蛋白F-actin的空间分布; 右侧图像为AFM形貌图和经仿射变换后的dSTORM图像间的叠加图,显示出具体蛋白F-actin在形貌图中的定位分布情况, 表明利用dSTORM成像得到的特异性标记蛋白F-actin的分布与AFM形貌图中的纤维状结构重叠,证明AFM-dSTORM联用显微镜能够将特定蛋白分子精确定位到AFM形貌图中。为进一步定量分析AFM和dSTORM图间的匹配效果, 通过比较dSTORM定位点出现在基底处(h=0)以及F-actin处(h>0)的几率来确定以及优化这两种图像间的重叠程度,即比较h=0及h > 0处的dSTORM定位点密度。如图3B所示,h > 0处的dSTORM定位点密度为2353 μm-2,而h=0处的dSTORM定位点密度只有318 μm-2,表明dSTORM定位点出现在F-actin处的几率大于出现在基底处,即证明AFM和dSTORM图像间的重叠程度很好。综上,此联用仪器可实现在单分子水平上对具体成分的空间分布和整体形貌间的关联分析。4 结 论
本文编号：3513219
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