SIM显微镜照明结构光场优化与系统点扩散函数表征

发布时间：2017-07-08 04:03

  本文关键词：SIM显微镜照明结构光场优化与系统点扩散函数表征

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【摘要】：荧光显微镜具有可特异性标记、对活体细胞实时动态成像等优势,在细胞生物学研究中获得广泛的应用。然而,由于衍射极限的存在,传统荧光显微镜的分辨率受到限制。这严重阻碍了传统荧光显微镜在亚细胞水平研究中的进一步应用。为了突破衍射极限的限制,近年来,研究人员提出了一系列超分辨荧光显微技术。尽管如此,长时间活细胞成像对这些方法仍然存在着较大的挑战。结构光照明超分辨荧光显微成像技术(Structured Illumination Microscopy,SIM)是根据莫尔效应提出的一种技术。其原理为:利用空间有结构的光束来激发荧光,激发图形和荧光团密度的混合频率,将样品中通常不可见的高频信息携带到显微镜的可见低通频带;通过改变图案的方向和相位,记录荧光结果并对得到的多个图像数据集进行适当的处理,提取携带的高频信息并重建出超分辨率图像。SIM横向分辨率理论上可以达到传统荧光显微镜的两倍,且其成像速度快,对荧光标记没有特殊要求。这些特点使得SIM在细胞生理学、细胞动力学等亚细胞水平的生命科学研究中有更广阔的应用前景。本文基于LED光源和可编程数字微镜阵列(Digital Micro-mirror Device,DMD),设计和搭建了结构光照明超分辨荧光显微镜。利用设计的结构光生成模块与奥林巴斯X73显微镜结合做成了SIM超分辨成像系统,并设计了SIM超分辨重构算法。对使用LED、DMD和物镜结合产生余弦结构光进行了理论分析以及仿真实验。通过理论分析、仿真以及实验,提出了使用荧光微球精确测量系统分辨率的新算法。使用自搭建显微镜(40倍、数值孔径0.75的物镜)对细胞肌动蛋白丝(激发/发射波长:650nm/668nm)成像,测量得到SIM系统分辨率为307nm,传统宽场荧光显微镜系统分辨率为545nm,较传统荧光显微镜SIM系统分辨率提高了1.78倍;使用自搭建结构光生成模块和奥林巴斯显微镜(100倍、数值孔径1.4的物镜),对直径200nm的荧光微球(激发/发射波长:660nm/680nm)成像,测量宽场成像和SIM成像中荧光微球半高宽(Full Width at Half Maximum,FWHM)分别为328nm、203nm,利用本文设计的系统分辨率测量算法,得到宽场显微镜系统和SIM超分辨成像系统的分辨率分别为312nm、170nm,较传统宽场荧光显微镜,SIM系统的分辨率提高了1.84倍。实验表明,本文搭建的基于LED和DMD的结构光照明超分辨荧光显微镜系统突破了衍射极限的限制,实现了超分辨荧光成像。
【关键词】：荧光显微镜 超分辨率 结构光 衍射极限 数字微镜阵列
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(长春光学精密机械与物理研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TH742
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-23
• 1.1 研究背景及意义11
• 1.2 荧光显微镜系统的分辨率11-14
• 1.2.1 阿贝定律12
• 1.2.2 瑞利判据12-13
• 1.2.3 半高宽(Full Width at Half Maximum, FWHM)13-14
• 1.3 提高显微镜分辨率的一般方法14-17
• 1.3.1 去卷积显微镜14-15
• 1.3.2 共聚焦显微镜15-16
• 1.3.3 双光子荧光显微镜16-17
• 1.4 超分辨率显微技术17-22
• 1.4.1 基于单分子定位的超分辨成像技术18-19
• 1.4.2 基于模式照明的超分辨成像技术19-22
• 1.5 本论文的主要工作22-23
• 第2章 SIM基本原理23-31
• 2.1 宽场荧光显微镜成像原理23-25
• 2.2 结构光照明荧光显微镜成像原理25-27
• 2.3 结构光照明荧光显微镜算法27-30
• 2.3.1 频谱分离27-28
• 2.3.2 频谱配准28
• 2.3.3 频谱融合28-30
• 2.4 本章小结30-31
• 第3章 结构光场优化31-47
• 3.1 结构光生成模块设计及整体光路介绍31-35
• 3.1.1 传统结构光照明光生成方案31
• 3.1.2 本文结构光照明光生成方案及整体光路介绍31-33
• 3.1.3 LED光源介绍33
• 3.1.4 数字微镜阵列(DMD)介绍33-35
• 3.2 基于LED和DMD的余弦光生成原理及仿真35-44
• 3.2.1 基于LED和DMD的余弦光生成原理35-38
• 3.2.2 DMD产生的矩形波测试38-41
• 3.2.3 基于LED和DMD的余弦光生成理论仿真41-44
• 3.3 结构光生成模块设计44-45
• 3.4 本章小结45-47
• 第4章 系统点扩散函数测量47-57
• 4.1 系统点扩散函数测量方法简介47-48
• 4.2 系统点扩散函数测量原理48-49
• 4.3 BSF与PSF半峰全宽的关系模型49-52
• 4.4 宽场荧光显微镜点扩散函数测量52-53
• 4.5 使用荧光微球测量系统点扩散函数的算法53-56
• 4.5.1 提取荧光微球矩阵大小53-54
• 4.5.2 荧光微球定位算法54-56
• 4.6 本章小结56-57
• 第5章 超分辨成像实验57-73
• 5.1 成像系统标定57-61
• 5.1.1 SCMOS前的管透镜介绍57-59
• 5.1.2 系统定标59-61
• 5.2 细胞肌动蛋白微丝的超分辨成像61-68
• 5.2.1 实验条件61-62
• 5.2.2 细胞肌动蛋白微丝(Actin Filaments)制作62-63
• 5.2.3 实验结果与分析63-66
• 5.2.4 系统性能分析66-68
• 5.3 荧光微球的超分辨成像68-72
• 5.3.1 实验条件68-69
• 5.3.2 实验结果与分析69-72
• 5.4 本章小结72-73
• 第6章 总结与展望73-75
• 6.1 本文主要内容和研究结论73-74
• 6.2 创新点74
• 6.3 展望74-75
• 参考文献75-81
• 在学期间学术成果情况81-82
• 指导教师及作者简介82-83
• 致谢83

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本文编号：532907