基于荧光时空调控的超分辨显微方法与系统研究

发布时间：2017-08-02 19:19

  本文关键词：基于荧光时空调控的超分辨显微方法与系统研究

  更多相关文章： 超分辨 荧光显微术 点扩散函数工程 STED 荧光漂白

【摘要】：远场光学显微成像技术具有无损、特异性强、穿透深度深等优点,是生物医学研究中的重要工具。然而,由于光学衍射极限的存在,远场光学显微成像技术的分辨率被限制在200nnm左右,无法满足现代生物医学研究的需求。共聚焦显微技术可以有效提高远场光学显微成像技术的分辨率,然而其分辨率依然受到光学衍射极限的限制。荧光显微成像技术具有高信噪比、特异性强、多参量等优点,特别适用于长时程生物样品的观测。荧光显微的“选择性标记,选择性激发”的成像特点,理论上可以突破衍射极限的限制。因此,基于荧光理论的超分辨显微术是远场光学超分辨显微技术中的代表性技术。然而,现有的超分辨技术仍存在很多问题,例如分辨率不够高、系统复杂、样品适用范围窄、成像速度慢等。本论文基于荧光能级理论与共聚焦技术,通过对荧光进行时空调控,旨在获取分辨率更高、系统更加简化、对荧光样品适用范围更广、更多元的光学超分辨显微方法和系统,实现荧光样品的亚百纳米分辨率成像。主要工作和创新点如下：(1) 提出了两种基于探测点扩散函数调制的超分辨方法和系统：通过对普通共聚焦系统进行简单的改造,以及对荧光的“虚拟空间调控”,基于探测点扩散函数调制的超分辨方法和系统具有分辨率高、实时成像、信噪比高、系统结构简单、样品适用范围广等优点。(2) 基于时间门控技术和基于受激辐射的荧光时空调控技术,提出了一种离线式时间门控STED超分辨系统；同时利用荧光寿命分布,创新性地提出了一种基于荧光寿命分布的光斑对准方法：本系统获得38nm-50nm的高分辨率,同时相对于普通STED,系统得到了大大的简化,所需受激辐射光强也大大减弱。(3) 设计并搭建了一套基于STED和FED双模式快速扫描超分辨显微系统：创造性地将STED和FED两类超分辨技术集成在同一套系统中,本系统具有样品适用范围广、成像速度快、分辨率高等特点,系统STED模式可以获得110nm左右分辨率,FED模式可以获取140nnm左右分辨率。(4) 研究了STED系统中抗漂白封片荆、颗粒样品、生物样品的相关制备方法,对于缓解STED方法中样品的漂白问题有重要意义。(5) 提出了一种共聚焦系统下基于荧光漂白与荧光随机定位超分辨方法：针对荧光显徽成像中的漂白问题,“变废为宝”。本方法采用普通的共聚焦结构,有非常高的应用意义。基于荧光漂白与荧光随机定位超分辨方法具有高分辨率、样品适用范围广、系统结构简单等优点。
【关键词】：超分辨 荧光显微术 点扩散函数工程 STED 荧光漂白
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TP391.41;TH742
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-22
• 1 绪论22-42
• 1.1 光学显微成像的早期探索22-24
• 1.2 荧光显微成像技术24-27
• 1.2.1 荧光能级图25-26
• 1.2.2 几个重要的荧光概念26-27
• 1.2.3 常见非荧光过程27
• 1.3 共聚焦显微成像技术27-29
• 1.4 远场光学超分辨显微成像29-36
• 1.4.1 研究意义29-30
• 1.4.2 基于点扩散函数工程的远场光学超分辨显微成像方法30-31
• 1.4.3 基于荧光随机定位方法的远场光学超分辨显微成像方法31-33
• 1.4.4 基于频域扩展的远场光学超分辨成像方法33-34
• 1.4.5 其他远场光学超分辨成像方法34-36
• 1.5 现有技术的缺陷和不足36-37
• 1.6 本论文的研究内容及创新点37-41
• 1.6.1 本论文的研究内容37-38
• 1.6.2 本论文的结构38-40
• 1.6.3 本论文的创新点40-41
• 1.7 本章小结41-42
• 2 基于探测点扩散函数空间调控的超分辨方法和系统的研究42-70
• 2.1 引言42-43
• 2.2 理论基础43-50
• 2.2.1 标量衍射理论43-44
• 2.2.2 标量衍射理论的聚焦模型44-46
• 2.2.3 光学显微成像分辨率46-48
• 2.2.4 提高显微系统分辨率的传统方法48-49
• 2.2.5 其他限制分辨率的因素49-50
• 2.3 基于探测点扩散函数横向位移差分的成像方法和系统研究50-61
• 2.3.1 技术背景50-52
• 2.3.2 系统设计52-53
• 2.3.3 理论分析53-54
• 2.3.4 参数优化54-57
• 2.3.5 LDCM实验验证57-58
• 2.3.6 偏振与信噪比对成像效果的影响分析58-60
• 2.3.7 小结60-61
• 2.4 基于探测点扩散函数孔径函数调制的超分辨方法和系统的研究61-68
• 2.4.1 技术背景61
• 2.4.2 系统设计61-62
• 2.4.3 理论分析62-65
• 2.4.4 实验验证65-68
• 2.4.5 小结68
• 2.5 基于探测点扩散函数空间调控的超分辨方法的特点总结68-69
• 2.6 本章小结69-70
• 3 基于受激辐射的时空调制超分辨显微系统及成像研究70-106
• 3.1 引言70-71
• 3.2 系统总体介绍71-73
• 3.3 照明模块设计73-82
• 3.3.1 波长的选择73
• 3.3.2 激发光的重频选择73-74
• 3.3.3 聚焦光斑理论优化74-78
• 3.3.4 激发光路描述78-79
• 3.3.5 受激辐射光光路描述79-80
• 3.3.6 照明光路偏振调制80-81
• 3.3.7 扩束系统存在的意义81
• 3.3.8 反射面型对照明光聚焦光斑的影响81-82
• 3.4 扫描模块设计82-83
• 3.5 探测模块设计83-84
• 3.5.1 探测模块组成83
• 3.5.2 探测光路描述83-84
• 3.5.3 多模光纤芯径大小84
• 3.6 系统光斑对准84-87
• 3.6.1 光斑对准的意义84-85
• 3.6.2 光束粗对准过程85-86
• 3.6.3 精细校准86-87
• 3.7 基于荧光寿命分布的光斑新对准方法87-93
• 3.7.1 研究背景87-88
• 3.7.2 理论基础88-90
• 3.7.3 实验验证90-93
• 3.8 时间门控连续光受激辐射损耗超分辨93-97
• 3.8.1 理论描述93-95
• 3.8.2 离线式时间门控技术的重要性95-96
• 3.8.3 离线式时间门控的操作96-97
• 3.9 成像结果97-100
• 3.9.1 暗斑成像效果97
• 3.9.2 纳米颗粒成像结果97-98
• 3.9.3 生物样品成像结果98-100
• 3.10 系统信噪比问题100-104
• 3.10.1 信噪比与分辨率100
• 3.10.2 反卷积算法提升信噪比100-103
• 3.10.3 双门控提升信噪比方法103-104
• 3.11 本章小结104-106
• 4 基于STED和FED双模式快速扫描的空间调制超分辨系统及成像研究106-126
• 4.1 引言106
• 4.2 FED技术简介106-109
• 4.2.1 FED技术发展106-107
• 4.2.2 FED基本原理107-109
• 4.3 系统的设计与调试109-117
• 4.3.1 系统总体介绍109-110
• 4.3.2 FED成像光路描述110-111
• 4.3.3 STED成像光路描述111-112
• 4.3.4 振镜扫描模块112-114
• 4.3.5 系统重要参数计算114
• 4.3.6 系统控制与信号传递114-117
• 4.4 系统光斑校准117-120
• 4.4.1 粗对准117-118
• 4.4.2 FED双光束重合118
• 4.4.3 STED双光束重合118-120
• 4.5 成像结果分析120-124
• 4.5.1 STED模式成像120-121
• 4.5.2 FED模式成像121-123
• 4.5.3 易漂白样品双模式测试123-124
• 4.6 本章小结124-126
• 5 STED超分辨系统中的样品制备126-132
• 5.1 引言126
• 5.2 高功率下STED成像可能存在的问题126-128
• 5.2.1 荧光样品漂白126-127
• 5.2.2 荧光样品燃烧127-128
• 5.3 样品制作方式选择128
• 5.4 封片剂的选择与制备128-129
• 5.4.1 Mowiol制作过程128-129
• 5.4.2 TDE制作过程129
• 5.5 颗粒样品的制备过程129-130
• 5.6 生物细胞的制备过程130-131
• 5.7 本章小结131-132
• 6 基于荧光漂白与荧光随机定位的时间调制超分辨方法和系统的研究132-144
• 6.1 引言132
• 6.2 技术背景132-133
• 6.3 系统要求133-135
• 6.3.1 系统光路描述133-134
• 6.3.2 系统控制和电信号处理134-135
• 6.3.3 系统成像重要参数设定135
• 6.4 理论分析与仿真135-139
• 6.4.1 方法流程135-137
• 6.4.2 恢复算法选择137
• 6.4.3 方法仿真137-139
• 6.5 成像结果分析139-142
• 6.5.1 荧光颗粒样品139-140
• 6.5.2 生物细胞140-142
• 6.6 本章小结142-144
• 7 总结与展望144-146
• 参考文献146-158
• 作者简介158-160
• 攻读博士学位期间主要的研究成果160-162

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本文编号：610830