基于二硫化钼的荧光生物传感器在核酸分析中的应用研究

发布时间：2018-03-20 11:31

本文选题：核酸分析　切入点：荧光生物传感器　出处：《湖北中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：遗传信息以特定核苷酸序列的形式贮存在核酸分子中,对核酸分子的序列、结构及含量的分析在医学领域中有重要的应用价值,如疾病早期预防、肿瘤早期诊断、各种相关疾病诊断、疗效监测以及个体化治疗等。特定序列的核酸分子能够识别目标分子或催化某些反应,基于核酸的特异识别作用从而设计和发展各种快速简单的核酸分析方法一直以来都是分子诊断技术方面关注的热点。传统的核酸分析方法包括毛细管电泳法、变性高效液相色谱法、DNA微阵列法、变性梯度凝胶电泳法和温度梯度凝胶电泳法等,这些方法大都是在PCR的基础上实现核酸分析。然而这些传统的核酸分析方法存在以下主要缺陷:需要较多较纯的PCR产物、实验成本高、实验步骤繁琐以及耗时等。近年来,一些新型核酸分析方法克服了传统方法的不足,其中,DNA生物传感器因其实验成本较低、灵敏度高、特异性好等优势在核酸分析领域得到快速发展。与其他DNA生物传感器相比,荧光DNA生物传感器在核酸分析诊断中应用较广泛,因为该传感器有其独特的优势,比如样品前处理容易、实验操作简单、响应迅速、易与其他方法联用以及无需参比器件等。在荧光传感技术中,荧光探针发挥着重要的作用,而传统荧光探针在应用于生物传感等研究时,聚集诱导猝灭(ACQ)现象是其研究发展中最大的阻碍。20世纪80年代末90年代初,纳米技术逐步应用于生物传感器领域,并已取得了突破性的进展,其中纳米材料的应用是纳米生物传感技术领域最具活力、最有潜力、最有研究价值的一个分支。随着2004年英国两位科学家Konstantin Novoselon和Andre K.Geim发现了石墨烯,使类石墨烯二维纳米材料,尤其是过渡金属二硫化物纳米材料(Transition metal dichalcogenides,TMDs)在生物传感技术中的应用逐步被重视。相对于石墨烯,TMDs可以很容易地大规模合成并直接分散在水溶液中,而无需表面活性剂或氧化等额外复杂的处理。除此之外,TMDs因其优良的猝灭能力在荧光纳米生物传感领域中非常有前景,而二硫化钼又是TMDs最典型且常用的代表材料。本工作中,将二硫化钼纳米片与荧光探针相结合,利用MoS_2其较高的猝灭能力和能有效的区分ss-DNA和ds-DNA的特性,以及后来对荧光探针的改良,致力于提高检测灵敏度和特异性等,发展了一系列分别以DNA甲基化和DNA为检测对象的简单快速核酸分析的荧光生物传感技术。具体研究内容分别如下:(1)基于二硫化钼荧光生物传感器用于DNA甲基化的快速分析DNA甲基化是一种重要的肿瘤标志物,建立一种简单、快速和灵敏的DNA甲基化分析方法较为重要。Bst UI,是一种对人类5’-CGCG-3’位点敏感的限制性内切酶,然而当此位点发生半/全甲基化时其酶切功能丧失。设计以荧光素标记的DNA为探针,二硫化钼纳米片为荧光猝灭剂和传感平台,利用限制性内切酶Bst UI特异性剪切能力,建立一种简单的荧光传感方法用于在匀相中对p16启动子DNA甲基化快速分析。该传感方法展现了不错的灵敏度,可用于区分低至1%的甲基化水平级别的混合物。相比之前报道甲基化水平分析,这种巧妙地免亚硫酸盐处理的设计不仅可以避免PCR的局限性,而且具有良好的特异性,灵敏度高,检测时间短(3h)和操作方便等的优点。(2)基于聚集诱导发光探针和二硫化钼的DNA生物传感器的初步研究在以MoS_2为检测平台的基础上,对传统荧光探针的改良是本章研究的重点。TPE分子的合成成本低廉,免标记的荧光探针能克服传统荧光探针诸如ACQ现象、光漂白等问题。以四苯乙烯(TPE)衍生物与DNA相结合为免标记的荧光探针,二硫化钼纳米片为荧光猝灭剂和传感平台,利用TPE的聚集诱导发光(AIE)效应建立一种免荧光标记的荧光核酸生物传感器。TPE作为典型的AIE分子,它在分散溶液中不发光或发微弱的光,但是当加入DNA时,则DNA和探针聚集形成复合物,发射很强的荧光信号。但是TPE对单链DNA和双链DNA无任何选择性。于是,可以通过二硫化钼纳米片的高荧光猝灭效率和对单、双链核酸的选择性吸附作用,从而实现免标记荧光核酸分析。由于本课题只是初步构建了基于TPE探针和二硫化钼的DNA生物传感器,目前已比较三种常用TPE衍生物的信噪比选择出适合本实验的AIE分子,并通过荧光光谱图证明了本方法具有较好的可行性。在今后的研究中,继续深入实验条件的优化,实验灵敏度和特异性以及临床实际样本的研究。
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【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R440;TP212.3

【参考文献】