固定化GABA受体及固定化大鼠小肠组织的电化学生物传感器的研究

发布时间：2019-03-19 12:23

【摘要】：睡眠问题影响着现代人的健康,透支着人们的身体,成为许多疾病的诱因,以及成为高血压、糖尿病以及青少年智力发育的重要影响因素,因此解决当代人的睡眠问题是解决许多其他疾病的关键所在,解决睡眠问题迫在眉睫。现在临床上使用的安眠类药物一般是安眠类西药,如地西泮、巴氯芬等。但是此类药物只能在短期内解决睡眠,长期用药会造成耐药性和诱发其他不良反应,因此寻找安全有效的替代类药品解决问题的根源所在。酸枣仁是一种具有安眠镇静作用的传统中药,在著名古籍《本草纲目》和《神农本草经》中都早有记载。现代研究表明:酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B是酸枣仁中主要起作用的物质,其中以酸枣仁皂苷A含量最多,也是安眠镇静的主要活性成分。电化学生物传感器是一种利用电化学作为换能器,利用生物活性元件作为敏感元件的精致测量仪器。基于此,本研究利用两种不同的生物学元件——GABA_BR1a受体和大鼠的小肠组织制作两种不同电化学生物传感器,均对酸枣仁皂苷A与其受体GABA_BR1a的作用进行检测。取成年SD大鼠小肠组织,清洗干净并将整段的小肠进行分段,取空肠段中间的一小段,然后将其制成面积约为0.25 cm~2的单层膜,使用淀粉-海藻酸钠为固定剂,将该测定膜固定在两张核微孔膜,最后在固定在中间玻碳电极表面制成“三明治”结构的测定膜,此为本研究所使用的生物敏感元件。该组装过程每一步都使用循环伏安法进行表征。然后利用电化学工作站,将组装好的电极用时间电流法对不同浓度的酸枣仁皂苷A溶液进行定量化检测。结果表明在一定浓度范围内小肠组织与酸枣仁皂苷A呈现双曲线,使用双曲线模型进行回归拟合,相关系数(R~2)为0.98615;经过分析,使用双倒数法(Lineweaver-Burk方程)作图并进行回归分析,R~2为0.99002,并进一步计算得出受体-配基相互作用激活常数为5.0035×10~(-16)mol/L。通过与裸电极相比,进一步推导分析计算得出信号放大倍数为108倍,以及计算得出小肠细胞上GABA受体的个数约为5个。使用该同一只传感器对同一样品测定10次,R.S.D为4.98%,对不同批次的该传感器5支进行测定,R.S.D为2.346%,说明该传感器的重现性良好;电极保存在4℃的PBS上方,第3天时为最初响应信号的89.47%,第7天时为84.79%,说明该传感器稳定性良好。通过NCBI查找GABA受体基因GABA_BR1a,利用真核表达载体pcDNA3.1获得重组质粒,使用脂质体转染法转染至HEK-239T细胞,利用HEK-239T细胞的表达系统培养表达获得目的蛋白,至此获得本研究所需要的第一种生物活性物质。然后利用自组装等方法,在玻碳电极表面依次固定壳聚糖、纳米金溶胶、GABA_BR1a蛋白溶液、硫堇-壳聚糖混合物、辣根过氧化物酶-纳米金溶胶、GABA_BR1a蛋白溶液,最后用牛血清白蛋白封闭。该组装过程每一步都使用循环伏安法进行表征。然后使用电化学工作站,将组装好的电极用时间-电流法对不同浓度的酸枣仁皂苷A溶液进行定量化检测。结果表明在一定浓度范围内GABA_BR1a与酸枣仁皂苷A呈现双曲线,使用双曲线模型进行回归拟合,相关系数(R~2)为0.97435;使用双倒数法(Lineweaver-Burk方程)作图并进行回归分析,R~2为0.96416,并进一步计算得出受体-配基相互作用激活常数为4.758×10-15mol/L。说明该传感器在一定程度上可以模拟体内的信号传递过程,揭示了受体与配体相互作用的关系。使用该同一只传感器对同一样品测定10次,R.S.D为5.86%,对不同批次的该传感器5支进行测定,R.S.D为1.723%,说明该传感器的重现性良好;电极保存在4℃的PBS上方,第3天时为最初响应信号的92.54%,第7天时为88.79%,说明该传感器稳定性良好。通过上述两种不同的电化学生物传感器的研究,我们既在分子层面讨论了酸枣仁皂苷A与GABA受体的作用关系,又在组织层面揭示了小肠组织与酸枣仁皂苷A的相互作用。这对于酸枣仁皂苷A的药物评价以及G蛋白偶联受体药物的开发和筛选提供了一定的参考意义。同时该研究也提出了一种新的研究细胞信号传递的思路,揭示了细胞的信号放大倍数和细胞上的受体个数,这种思考方式以及细胞信号放大倍数和受体个数等参数对于今后关于药物筛选等方面的研究提供了新的思考方向。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;TP212.3

【参考文献】