胃泌素释放肽前体31-98片段核酸适配体的研究及其传感器的构建

发布时间：2019-11-19 16:00

【摘要】：核酸适配体(Aptamer)是利用配体指数富集的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)筛选得到的寡核苷酸片段,可以是单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)或者RNA。它可以与蛋白质或其他物质特异性结合,具有高选择性和高亲和力,具有比抗体更加稳定的化学性质,此外还具有低毒性、无免疫原性等优点,这使得核酸适配体在蛋白检测过程中有很大优势。通过SELEX技术可以简单快速得到高选择性和高亲和力的核酸适配体,在疾病的诊断和治疗中具有很广阔的前景。胃泌素释放肽前体 31-98 片段(Progastrin-releasing peptide 31-98,ProGRP31-98)是一种高度可靠的、特异性的、灵敏的小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer, SCLC)肿瘤标志物。血清中ProGRP31-98水平的测定使得对小细胞肺癌的诊断、预后预测及治疗监测成为可能。对ProGRP31-98水平的检测主要是利用酶联免疫技术(ELISA)、化学发光免疫技术(CLIA)等免疫学方法。目前还没有针对ProGRP31-98的核酸适配体被筛选出来,而本实验室利用SELEX技术筛选得到了 8条针对ProGRP31-98的核酸适配体序列。针对这些序列,我们从中选择出了特异性较强的核酸适配体,以一种DNA分子光开光化合物[Ru(bpy)2dppz]2+为探针,构建了一种无标记的电化学发光方法对核酸适配体的特异性进行检测,得到了一条89nt的ProGRP31-98核酸适配体以及它的随机区域(48 nt)的核酸适配体。基于得到的两条核酸适配体的二级结构,得到了另外两条经过截短的40 nt和15 nt的核酸适配体,这些核酸适配体与ProGRP31-98具有很强的亲和力,解离常数最低至16nM。利用无标记的电化学发光法可测得的最低检测极限为17 nM。由于血清中ProGRP31-98水平很低,这种无标记的电化学发光测定法的灵敏度不足够高。为了得到更加灵敏的检测,我们设计了一种电化学核酸适配体传感器。首先将3-疏基丙酸(3-MPA)通过金-硫键自组装到金电极表面,经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)活化表面羧基后固定链霉亲和素;再在核酸适配体两端分别修饰上巯基及生物素,诱导形成发夹结构后与另一种巯基修饰的发夹DNA (hairpin DNA)共同连接到金纳米颗粒上形成双发夹DNA修饰的纳米金复合物(hpDNA-AuNPs-Aptamer),该复合物作为信号放大元件,与ProGRP31-98孵育后导致核酸适配体结构改变使得生物素暴露,与链霉亲和素结合后连接到电极表面;再通过线性扫描(LSV)的方法将双功能电化学指示剂[Ru(NH3)5L]2+嵌入到纳米金复合物上的发夹DNA中,利用差分脉冲伏安法(DPV)测得钌(Ⅱ)的氧化电流信号,其中L为3- (2-菲-9-甲基-乙烯基)吡啶,能够嵌入到双链DNA分子,钌(Ⅱ)为氧化还原中心。我们对该传感器电极组装过程进行了表征并对初步的检测性能进行研究,对部分条件进行了优化。
【图文】：

核酸,文库,技术,靶物质

进一步的研究证明。逡逑１．１．２核酸适配体筛选方法简介逡逑基本的ＳＥＬＥＸ技术的思想如图１．１所示：首先在体外化学合成一个单链寡逡逑核苷酸文库，此文库两端为带有限制性内切酶位点的固定序列，是ＰＣＲ反应及逡逑其它酶反应相关引物的结合位点，中间为随机序列，由ｎ个碱基组成，此时文逡逑库的库容量为４ｎ，邋ｎ—般在２５－６０之间［１７］。寡核苷酸文库可以是ＤＮＡ文库，，也逡逑可以是ＲＮＡ文库，还可以是经修饰化的ＲＮＡ文库。通常这些文库的容量有逡逑１0１４－１0１５个单链寡核苷酸序列，与靶物质混合后，文库中与靶物质特异性识别的逡逑寡核苷酸就形成核酸－耙物质复合物，此时与靶物质相结合的寡核苷酸丰度较低。逡逑通过清洗除去多余核酸，再分离出和靶物质相结合的核酸分子，用该核酸分子逡逑作为模板进行ＰＣＲ扩增

活化机理,磁珠

下面以链霉亲和素磁珠的包被为例：逡逑１）清洗磁珠：将购买的ＳＭ３－Ｐ１００氧化硅羧基磁珠（１０邋ｍｇ／ｍＬ）混匀后，取逡逑２００ｆｉＬ邋（ｇｐ２ｍｇ）加入到邋１．５ｍＬＥＰ邋管中，用邋ＭＥＳＴ邋（ｐＨ６．０）洗涤两次，逡逑经磁力架分离后去除上清。逡逑２）羧基磁珠的活化：由于ＥＤＣ容易水解，所以需要新鲜配制。称取ｌｍｇｍＸ：逡逑溶解于２００邋ｕＬＭＥＳ邋（ｐＨ邋６．０）中，加入到清洗好的磁珠中，涡旋后将ＥＰ管逡逑放入分子杂交仪内，３７°Ｃ活化１邋ｈ；再称取１．９邋ｍｇ邋ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ，溶解于２００邋ｎＬ逡逑ＭＥＳ邋（ｐＨ６．０）中，加入到上述ＥＰ管内，混匀后继续反应ｌｈ。逡逑３）链霉亲和素与磁珠的偶联：经活化后，磁分离去除上清液，磁珠用ＭＥＳ邋（ｐＨ逡逑９．０）清洗两次，加入５０邋ｎＬ邋ｌｍｇ／ｍＬ链霉亲和素溶液，再加入４５０邋ｎＬ邋ＭＥＳ逡逑（ｐＨ邋９．０）使总体积为５００邋ｎＬ，混匀后于分子杂交仪内３０°Ｃ过夜偶联。逡逑４）链霉亲和素磁珠的保存：偶联好的磁珠经磁分离后，用ＰＢＳ邋（ｐＨ邋７．４）清洗逡逑一次，重悬于１邋ｍＬ邋ＰＢＳ邋（ｐＨ邋７．４），最终得到１邋ｍｇ／ｍＬ链霉亲和素包被磁逡逑珠，保存在４°Ｃ冰箱内备用。逡逑牛胰岛素磁珠、牛血清白蛋白磁珠、胃泌素释放肽前体３１－９８片段磁珠包被逡逑
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q789;TP212

【参考文献】