活性氮化物一氧化氮和过氧亚硝基阴离子荧光探针的构建和生物传感

发布时间：2020-03-24 19:30

【摘要】：一氧化氮(NO)是一种单电子自由基,能自由地在生物膜体系中扩散,在生物体内的代谢产物有N_2O_3、HNO、NO_2~-、NO_3~-,并且与O_2~(?-)反应生成过氧亚硝基阴离子(ONOO~-)。NO通过与细胞中金属蛋白质,自由基,蛋白质硫醇反应,调节细胞正常的生理功能。而ONOO~-通过氧化和硝化氨基酸,调节细胞正常的生理功能。因此,NO与ONOO~-成为生物体内重要的信号分子。荧光探针近年来成为NO和ONOO~-重要的检测工具,虽然已经报道了许多类型的NO与ONOO~-荧光探针,但其中也有不足之处。本论文从改变反应机理入手,设计合成了一系列新反应类型的NO,ONOO~-荧光探针,展开了以下工作:(1)我们首次创建了芳香二级胺与NO的亚硝化一步反应的设计策略。开发了以BODIPY为荧光团,N-苄基-4-羟基苯胺为识别基团的NO荧光探针2.1,并在2.1的结构基础上引入三苯基磷正盐(TPP)开发了能靶向线粒体的NO荧光探针2.2。探针2.1与NO简单的一步反应,以及羟基取代基的供电子能力,使该反应在数秒内完成,并且在与GSH,Hcy,Cys大量存在下,没有干扰与NO反应后的荧光信号,从而解决了探针响应速度的问题。通过吸收光谱和荧光发射光谱证明了探针2.1没有与其它ROS(ClO~-、H_2O_2,、O_2~(?-)、~1O_2和~?OH)发生化学反应,并且对于探针2.1与高活性的ClO~-,我们通过LC-MS分析,更加明确了两者没有发生反应。而且由于探针2.1结构以及与NO识别机理的原因,避免了DHA/AA/MGO的干扰。因此我们既解决了探针识别NO的荧光选择性问题,又解决了生物体系中潜在消耗探针的问题。通过探针2.1对NO的滴定,我们计算出2.1的检出限低至4 nM。2.2同样表现出识别NO速度快,专一性强,并且与商业化的线粒体探针进行了共定位,皮尔森系数高达0.92。探针2.1与2.2分别影像了HeLa细胞与RAW 264.7细胞中外源性和内源性的NO。(2)我们首次创建了芳香三级胺与ONOO~-生成相应的N-亚硝基,氮-氧化合物的设计策略,开发了以BODIPY为荧光团,N,N-二苄基-4-甲氧基苯胺为识别基团的ONOO~-荧光探针3.1,并在3.1的结构基础上引入TPP开发了能靶向线粒体的ONOO~-荧光探针Mito-3.1,并引入吗啡啉,首次开发了能靶向溶酶体的ONOO~-荧光探针Lyso-3.1。探针3.1与ONOO~-的特异性反应以及甲氧基的供电子能力,使该探针能在数秒内完成反应,并且在1 mM二氧化碳与3.1共存下,没有干扰探针与ONOO~-的荧光信号,从而解决了探针响应速度的问题。通过吸收光谱与荧光光谱,证明了3.1没有与其它ROS(ClO~-、H_2O_2、O_2~(?-),、~1O_2,~?OH)发生反应,而且与其它ROS共存下,没有干扰探针3.1与ONOO~-反应后的荧光信号。以上解决了探针识别ONOO~-荧光选择性的问题以及生物体系中潜在消耗探针的问题。通过3.1对ONOO~-的滴定,计算出3.1的检出限低至0.15 nM。Mito-3.1,Lyso-3.1与3.1相似识别ONOO~-速度快,专一性好,并且分别与商业化的线粒体探针和溶酶体探针共定位,皮尔森系数分别为0.92,0.84。探针3.1,Mito-3.1,Lyso-3.1分别影像了HeLa细胞,RAW264.7细胞中外源性和内源性的ONOO~-,并且3.1首次被应用于检测糖尿病老鼠模型中的ONOO~-(肾切片,肝切片)。(3)我们利用已创建的芳香三级胺与ONOO~-特异性反应策略和PeT荧光开关机理,开发了以水溶性好,光稳定性强的硅罗丹明为荧光团,N,N-二苄基-4-甲氧基苯胺为识别基团的ONOO~-近红外荧光探针4.1。4.1继承了3.1的优异性质,与ONOO~-在数秒内完成反应,不受其它ROS(ClO~-、H_2O_2、O_2~(?-)、~1O_2,~?OH)的干扰。并且4.1与二氧化碳共存下,没有干扰4.1与ONOO~-反应后的荧光信号。检出限低至3 nM。4.1在HeLa细胞中用激光照射60分钟,没有引起任何的荧光强度,表明4.1抗光氧化能力强。4.1与ONOO~-在细胞中反应后用激光照射60分钟,荧光强度基本没有衰减,表明产物抗光漂白能力强。这些性质达到了长时间影像ONOO~-的要求。探针4.1分别在HeLa细胞和RAW 264.7细胞中影像了外源性和内源性的ONOO~-,而且影像了STZ刺激胰岛β-细胞及糖尿病老鼠模型中的ONOO~-(活体/肾切片/肝切片),同时评估了苯酚类抗氧化药物对内皮细胞EA.hy926缺血再灌注模型的治疗效果。
【图文】：

子荧光探针适用于研究生命过程，生物疾病，而且已经成为生命及药物的设计，筛选等领域必不可少的研究工具。设计合成能特的荧光探针和运用生物成像技术挖掘荧光探针在生物研究方面的未知的生命活动，依然是前沿交叉研究领域的热点。原理的简介是一种光致发光的冷光现象。如图 1.1 所示[1]，荧光物质吸收合适子从基态（S0）跃迁到激发态，处于高能量激发态的电子通过非（VT）和内转化（IC）的方式回到第一单重激发态（S1），，然后通光子回到基态（S0），发射的光子叫做荧光。同样也是一种光致冷发光现象。磷光物质吸收合适能量的光子，电迁到激发态，处于高能量激发态的电子通过非辐射跃迁系间窜越（发三重态（T1），再经过振动弛豫（VT）回到最低能级的第一激发三重跃迁释放光子回到基态（S0），这种发光叫磷光。

图 1.3 探针分子与分析底物作用示意图。是探针分子与目标分子之间发生的弱相互作用，根据文献的报导电引力、范德华力、配位键、氢键，偶极-偶极相互作用力等。改变探针分子的性能（波长、强度、荧光寿命），是最开始荧光[25]。这类探针的优点是探针分子与目标化合物之间的相互作用测生物目标分子的动态变化。但此类荧光探针普遍不灵敏，不体系的极性改变会导致弱相互作用发生很大变化，尤其是在水位键等作用会变得很弱，导致该类型荧光探针的灵敏度不高。则是利用探针分子与目标分子发生温和的化学反应，即反应型相互作用可以改变探针分子取代基的供-拉电子能力和探针结构螺环的开关环等，使探针体系的荧光性能发生改变，从而达到的[7-12]。这类探针的优点是探针与目标分子发生不可逆的化学变荧光强度得到充分的积累，提高了荧光探针的灵敏度。但缺点
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3;TP212.3

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本文编号：2598754